植物氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途
植物氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)硝基藍(lán)四氮唑染料，受到超氧陰離子O2-的還原，產(chǎn)生不溶性藍(lán)黑色色素沉淀，由分光光度儀比色分析，定量檢測(cè)樣品超氧陰離子活性氧族的生成和增加的的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線(xiàn)態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍(lán)四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍(lán)（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），一旦受到超氧陰離子O2-的直接還原，便產(chǎn)生不溶性藍(lán)黑色甲暨色素，在分光光度儀下（540nm波長(zhǎng)），呈現(xiàn)吸光峰值的變化。據(jù)此定量檢測(cè)植物組織細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的濃度。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 毫升
陰性液（Reagent E） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）避免光照；有效保證6月
用戶(hù)自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣品準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定500克組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的1毫升裂解液（Reagent B）
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
10．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
11．（選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)?，重?fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
12．即刻移入到1.5毫升離心管
13．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford）
14．放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)540nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）避免光照
三、 背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取800微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100微升陰性液（Reagent E）
3． 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在37℃溫度下孵育60分鐘
6． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照
四、 樣品測(cè)定
1． 移取微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入微升待測(cè)樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
3． 加入微升反應(yīng)液（Reagent D） 2
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在37℃溫度下孵育60分鐘
6． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)
五、計(jì)算樣品濃度
六、 酶標(biāo)板測(cè)定
1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2． 分別移取200微升緩沖液（Reagent C）到96孔板的所有孔中
3． 分別加入25微升陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
4． 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）到96孔板的所有孔中
5． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
6． 在37℃溫度下孵育60分鐘
7． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
8． 濃度計(jì)算：
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿）或80次（酶標(biāo)板）操作
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 孵育時(shí)，避免光照
4． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
5． 建議使用比色皿測(cè)定
6． 樣品須澄清，至關(guān)重要
7． 測(cè)定值由低到高變化
8． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
9． 如果超氧陰離子活性氧濃度過(guò)低，可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間至4小時(shí)
10．建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本濃度過(guò)低或過(guò)高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－）
11．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
12．本公司提供系列活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感