免疫細(xì)胞或組織化學(xué)染色的相關(guān)問題

附上我們這里的組化步鄹：（切片復(fù)溫涼干完畢）

1。加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MPBS 20ml＋30%過氧化氫 1ml）30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5min×3；

2。加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100 1ml＋0.01MPBS 100ml）30min，以增加細(xì)胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3；

3。加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋疊氮納0.08g＋30% Triton X100 1ml）稀釋的*抗體4℃反應(yīng)24-48h。吸去抗體，0.01MPBS洗5min×3；

4。加入血清稀釋液或0.01MPBS稀釋的二抗，室溫孵育2h。吸去二抗，0.01MPBS洗5min×3；

5。加入ABC復(fù)合物，室溫孵育2h，0.01MPBS洗5min×3，蒸餾水迅速沖三次；

6。加入硫酸鎳銨溶液（DAB 25mg＋蒸餾水50ml＋硫酸鎳銨醋酸緩沖液50ml＋葡萄糖200mg＋氯化銨40mg＋葡萄糖氧化酶1mg），進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)顯色，時間不超過30min。不時在顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，蒸餾水迅速沖三次后加入0.01MPBS終止反應(yīng)；

或直接加入配好的DAB溶液進(jìn)行顯色。

7。梯度酒精（70％、80％、90％酒精5min×1，95％酒精5min×2，100％酒精5min×3）脫水之后，二甲苯透明，中性樹脂封片。
而對培養(yǎng)的細(xì)胞則比較簡單：（細(xì)胞種在玻片上）

1。固定液固定10－30min，0.01MPBS清洗2min×3；

2。羊血清封閉液封閉（可以加入0.3% Triton X100 ）30－60min分鐘；

3。加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋疊氮納0.08g＋30% Triton X100 1ml）稀釋的*抗體室溫反應(yīng)1－2h或4℃過夜。吸去抗體，0.01MPBS洗2min×3；

4。加入血清稀釋液或0.01MPBS稀釋的二抗，室溫孵育1h。吸去二抗，0.01MPBS洗2min×3；（如果是熒光二抗就可以直接用50％甘油封片，進(jìn)行觀察了）

5。加入ABC復(fù)合物，室溫孵育1h，0.01MPBS洗2min×3，蒸餾水迅速沖三次；

6。加入硫酸鎳銨溶液（DAB 25mg＋蒸餾水50ml＋硫酸鎳銨醋酸緩沖液50ml＋葡萄糖200mg＋氯化銨40mg＋葡萄糖氧化酶1mg），進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)顯色，時間不超過30min。不時在顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，蒸餾水迅速沖三次后加入0.01MPBS終止反應(yīng)；

或直接加入配好的DAB溶液進(jìn)行顯色。

7。梯度酒精（70％、80％、90％酒精5min×1，95％酒精5min×2，100％酒精5min×3）脫水之后，50％明膠封片。
1。脫片--
a）切片和貼片一定要過關(guān)；
b）冰凍切片從冰箱中拿出必須復(fù)溫并涼干（室溫1－2h）；
c）清洗切片時應(yīng)放在切片缸內(nèi)，沿缸壁倒入PBS，靜置5－10min，沒有晃動的必要。

2。染色背景太深，而且沒有陽性顯色--
a）灌注要要過關(guān)；
b）需用3％雙氧水甲醇溶液浸泡切片；
c）需用0.3-0.4%的triton溶液浸泡切片；
d）延長羊血清封閉時間；
e）降低一抗的濃度；（我有一次就是用了較高的一抗?jié)舛?，結(jié)果沒有染出東西，但是降低一抗?jié)舛群螅Y(jié)果非常好，其實(shí)這就是抗體的“prozone”--前區(qū)現(xiàn)象）

3。蘇木素復(fù)染