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疏水色譜是利用樣品分子與固定相的疏水力作用的不同，用流動相洗脫時，各組分遷移速度不同而達(dá)到分離的目的。流動相一般為pH 6-8的鹽水溶液，具有對蛋白質(zhì)的回收率高，蛋白質(zhì)變性可能性小等優(yōu)勢。由于流動相中不使用有機(jī)溶劑，也有利于蛋白質(zhì)保持固有的活性。
疏水作用色譜是在高離子強(qiáng)度的條件下，蛋白質(zhì)溶解度降低，易吸附在中等疏水性的填料表面。隨著離子強(qiáng)度的降低，蛋白質(zhì)的溶解度增加，逐步從柱子上洗脫下來。該法具有高分辨率及保持蛋白質(zhì)生物活性的特點。
疏水作用色譜的固定相表面為弱疏水性基團(tuán)，它的疏水性比反相色譜用的固定相低幾十到幾百倍，而流動相為高離子濃度的鹽溶液。蛋白質(zhì)分子在這樣的固定相和流動相中進(jìn)行分配，蛋白質(zhì)分子上的疏水性基團(tuán)和固定相的疏水基團(tuán)作用而被保留。當(dāng)用流動相洗脫時逐漸降低流動相的離子強(qiáng)度，洗脫能力增強(qiáng)。利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性 配體之間的作用強(qiáng)弱，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水作用由弱到強(qiáng)的組分分離開。蛋白質(zhì)分子按其疏水性大小被依次洗脫出來，疏水性小的先流出。在這樣的高鹽水溶液中，蛋白質(zhì)不會失活。高濃度鹽與水分子發(fā)生強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進(jìn)疏水性分子與介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合。這種疏水作用的大小取決于固定相和溶質(zhì)的極性、流動相的組成和濃度。由于各種蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基極性不同，因此有可能通過改變固定相的極性和流動相的組成使蛋白質(zhì)得到分離。
疏水層析的原理*不同于離子交換層析或凝膠過濾層析等技術(shù)，使該技術(shù)與后兩者經(jīng)常聯(lián)合使用來分離復(fù)雜的生物樣品。目前該技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細(xì)胞等分離時的有效手段
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