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            孔雀石綠快速檢測試劑盒說明書

            來源:上海研謹生物科技有限公司   2019年03月22日 13:24  

            EF21A\J1                      2016-01

            孔雀石綠

            快速檢測試劑盒說明書

            一、原理

            本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物孔雀石綠將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗孔雀石綠抗體,加入酶標記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠的含量成負相關,與標準曲線比較即可得出相應殘留物孔雀石綠的含量。

            二、試劑盒特性

            • 試劑盒靈敏度:   0.05ppb
            • 孵育溫度:       25
            • 孵育時間:       30min30min15min
            • 樣本檢測限

            水樣      ·······································  0.1ppb

            水產(chǎn)品    ·······································  0.5ppb    

            • 交叉反應率

            顯性孔雀石綠  ·································   100%

            隱性孔雀石綠  ································    0.1%

                  ····································    95%

            隱性結晶紫  ··································     0.1%

            • 樣本回收率

            水樣、水產(chǎn)品  ····························  80%~110%

            • 精密度

            板內、板間變異系數(shù)≤12%

            三、試劑盒組成

            1

            微量測試孔

            每條8孔,一板12條

            2

            10倍濃縮標準液×6瓶

            (1ml/瓶、黑色帽

            0ppb

            0.5ppb

            1.5ppb

            4.5ppb

            13.5ppb

            40.5ppb

            3

            酶標記物

            12ml

            紅色帽

            4

            抗體工作液

            7ml

            藍色帽

            5

            底物A液

            7ml

            白色帽

            6

            底物B液

            7ml

            黑色帽

            7

            終止液

            7ml

            黃色帽

            8

            20X濃縮洗滌液

            40ml

            白色帽

            9

            氧化劑

            3ml

            白色帽

            10

            4X濃縮復溶液

            50ml

            透明帽

            四、所用儀器、試劑

            具備的儀器:酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)、氮吹儀、恒溫箱

            微量移液器:單道 20200µl、單道1001000µl、多道 30300 µl

                  劑:乙腈、二氯甲烷、無水硫酸鈉、正己烷

            五、樣本前處理步驟

            • 樣本處理前須知

            a)實驗中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時要更換吸頭。

            b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必要時可對實驗器具進行清潔,以避免污染干擾實驗結果。

            • 樣本前處理需配制:

            配液1 樣品提取液  

                   乙腈-二氯甲烷混合溶液:

                     V乙腈-V二氯甲烷  =  4 : 1, 取40ml乙腈,

                  再加入10ml二氯甲烷,混勻后使用。

            配液2 樣品復溶液

                4X濃縮復溶液用去離子水按13稀釋

               (1份濃縮復溶液+3份去離子水),或按所

                需用量配制。

            • 樣本處理:
            • 水樣處理方法

               50µl清澈水樣樣直接測定(如果樣渾濁一定要過濾或4000r/min離心10min,直至得到清樣),暫不使用的樣本應冷凍保存。

            樣本稀釋倍數(shù):  1

            • 水產(chǎn)處理方法
            • 稱取2±0.05g均質組織樣品50ml離心管中,加入6ml樣品提取液(配液1),2g無水硫酸鈉,5min ,室溫(25℃左右4000r/min以上離心10min;
            • 3ml上清液,加入20µl氧化劑,搖勻,56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥;
            • 加入1ml正己烷,加入1ml樣品復溶液(配液2),振蕩搖勻1min,4000r/min以上離心5min
            • 下層50 µl用于分析;

            樣本稀釋倍數(shù):  1

            注:此方法所得到的結果為孔雀石綠;隱性孔雀石綠;結晶紫;隱性結晶紫的總量。

            六、 酶標免疫分析程序:

            • 測定前應須知:
            • 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(2025)。
            • 使用之后立即將所有試劑放回28。
            • ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
            • 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
            • 操作步驟:
            • 28冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(2025)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
            • 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于2-8。
            • 配液1:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液

            配液2:

            配制孔雀石綠標準液:取一定量的10倍濃縮

            標準液用樣品復溶10倍稀釋,現(xiàn)配現(xiàn)用,

            具體如下:

                標準液6配制4.05ppb標準液--50ul 40.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻;

                標準液5配制1.35ppb標準液--50ul 13.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻;

                標準液4配制0.45ppb標準液--50ul 4.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻;

            標準液3配制0.15ppb標準液--50ul 1.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻;

            標準液2配制0.05ppb標準液--50ul 0.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻;

            標準液1配制 0ppb標準液--50ul 0ppb

                     準液加450ul樣品復溶液混勻;

            • 編號:將樣本和標準品對應微孔按序編號,每個樣本和標準品做2孔平行,并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
            • 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加入抗體工作液50µl/孔,用蓋板膜封板,輕輕振蕩混勻。25環(huán)境中反應30min
            • 將孔內液體甩干,用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板45次,每次間隔1530秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
            • 每孔加入酶標記物100µl,蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應30min。將孔內液體甩干,用洗滌液充分洗,45遍(同上),用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
            • 顯色:加入底物A50µl/孔,再加入底物B50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25環(huán)境中避光顯色15min。
            • 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內讀數(shù)),測定每孔OD值。

            七、結果判定

            結果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含孔雀石綠量成負相關。

            1、粗略判定:

            用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標準液吸光度值分別是:0ppb2.243; 0.05ppb1.816;0.15ppb1.415;

             

            0.45ppb0.74;1.35ppb0.313;4.05ppb0.155。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb4.05ppb;樣本2的濃度范圍是0.15ppb0.45ppb,乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

            2、定量分析

            1)百分吸光率的計算,標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以個標準(0標準)的吸光度值,再乘以100%,即

            百分吸光%)=

            B

            ×100%

            B0

            B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

            B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

            2)標準曲線的繪制與計算

            以標準品百分吸光率為縱坐標,以孔雀石綠標準品濃ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標,繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

            若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,更便于大量樣本的準確、快速分析。

            八、 注意事項

            • 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫(2025℃)會導致所有標準的OD值偏低。
            • 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標準曲線不成線性,重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
            • 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
            • 反應終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
            • 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。
            • 不用的微孔板放進自封袋重新密封;標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
            • 顯色液若有任何顏色表明變質,應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時,表示試劑可能變質。
            • 該試劑盒理想反應溫度為25℃,溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

            九、儲藏條件和保質期

            • 儲藏條件:試劑盒于2-8保存,不要冷凍。
            •   期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

            提示:酶標板真空包裝袋若有漏氣,酶標板仍然正常有效,不影響實驗結果,請放心使用。

             

             

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