50303.2 v.A

組織NADPH細胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性

比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

組織NADPH細胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過NADPH細胞色素C還原酶反應系統(tǒng)中，細胞色素C還原后峰值的增高，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）或純化微粒體樣品NADPH細胞色素C還原酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術背景

NADPH細胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase；EC1.6.2.4），又稱為NADPH細胞色素C還原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase；CPR），是一種微粒體（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）內(nèi)電子傳導鏈的黃素蛋白酶，參與藥物、脂肪酸、固醇類、外源性化學分子等羥基化代謝作用，啟動脂質(zhì)過氧化作用。通過傳遞來自NADPH的電子到細胞色素b5或細胞色素P450家系的酶，包括血紅素氧合酶等，然后鏈接到脂肪酸去飽和酶（desaturase）和延伸酶（elongase）通路上。NADPH細胞色素C還原酶存在于所有組織細胞，肝組織高度表達，受到垂體-甲狀腺軸調(diào)控。NADPH細胞色素C還原酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標記蛋白，飲食類脂質(zhì)和生態(tài)污染的生物學標記?；诘孜镅趸图毎谻，在輔酶NADPH的存在下，由NADPH細胞色素C還原酶催化作用，產(chǎn)生還原型細胞色素C，由此出現(xiàn)吸光峰值的變化（550nm波長），來定量測定NADPH細胞色素C還原酶的活性。其反應系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）            毫升

裂解液（Reagent B）            毫升

緩沖液（Reagent C）            毫升

反應液（Reagent D）            毫升

底物液（Reagent E）            毫升

陰性液（Reagent F）            毫升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

超速離心機：用于樣品操作

比色皿或酶標板：用于反應和比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

一、樣品準備

1.手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時） 

2.（選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管

3.（選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4.移入一個液氮凍存管

5.即刻放進液氮罐過夜

6.次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）

7.放進一個15毫升錐形離心管

8.加入xx毫升預冷的裂解液（Reagent B）

9.渦旋震蕩5秒，充分混勻

10.即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器

11.在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約40下）

12.將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

13.放進4℃超速離心機離心30分鐘，速度為9000g

14.移取上清液到2個新的1.5毫升離心管

15.放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g

16.小心抽去上清液

17.分別加入xx微升裂解液（Reagent B）

18.合并到1個1.5毫升離心管

19.移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

20.即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準備

1．準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里

2．設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為550nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

三、背景對照測定

1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升反應液（Reagent D）

3．加入xx微升底物液（Reagent E）

4．放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

5．加入xx微升陰性液（Reagent F）

6．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：550波長讀數(shù)5分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘 

四、樣品活性測定

1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升反應液（Reagent D）

3．加入xx微升底物液（Reagent E）

4．放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

5．加入50微升待測樣品（注意：100微克微粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項10）

6．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數(shù)：550波長讀數(shù)5分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘

五、計算樣品活性

注意事項

1．本產(chǎn)品為20次（比色皿）操作，包括背景對照

2．操作時，須戴手套

3．系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4．樣品須澄清，至關重要 

5．加入樣品啟動反應后3秒內(nèi)即刻比色測定

6．分光光度計波長嚴格設置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號

7．測定值由低到高變化；測定可以持續(xù)5分鐘

8．測定值由低到高變化，即5分鐘測定讀數(shù)高于0分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性

9．比色測定后，比色皿須清洗*

10．建議待測樣本為微粒體，其蛋白濃度為100微克/50微升；待測樣本為組織裂解懸液，其總蛋白濃度為250至500微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1） 

11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

12．通常每毫克肝組織蛋白含有1至5毫單位NADPH細胞色素C還原酶

13．NADPH細胞色素C還原酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾細胞色素C所需的酶量作為一個活性單位

14．本公司提供系列NADPH細胞色素C還原酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感