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            裂谷熱診斷技術(shù)--ELISA方法

            來源:上海源葉生物科技有限公司   2011年06月15日 09:55  

            直到2000年,裂谷熱只限定在非洲流行,但是zui近在阿拉伯半島致死性的暴發(fā),表明需要快速診斷、有效地處理和預(yù)防這一疾病。

            該病由于沒有特征性的臨床癥狀,因此個(gè)別病例的診斷較為困難,但是該病具有以下流行特征:眾多動(dòng)物流產(chǎn),新生畜大批死亡,乃至人群發(fā)病。RVFV通常流行于非洲國(guó)家,流行常伴隨著特大降雨的周期循環(huán),較少發(fā)生在半干旱地區(qū)(30—35年的周期),或者較頻繁(3~10年的周期)發(fā)生在較大雨量的草原地區(qū)。

            經(jīng)典的檢測(cè)裂谷熱病毒抗體的參考方法是建立在多種形式的病毒中和試驗(yàn)(VN)和血凝抑制試驗(yàn)基礎(chǔ)上的,包括微量中和試驗(yàn),蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRN),小白鼠中和試驗(yàn)等,主要用來檢測(cè)不同動(dòng)物血清中的病毒特異性抗體,因只能用活病毒進(jìn)行試驗(yàn),不適合疫區(qū)外使用。盡管它們具有較高的靈敏度和特異性,但是價(jià)格昂貴且耗時(shí),那些方法的一個(gè)很大的不利之處是對(duì)試驗(yàn)人員具有健康風(fēng)險(xiǎn),并且限制了它們?cè)诜且邊^(qū)國(guó)家的使用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、血凝抑制(H1)、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)、免疫熒光試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等,均可用于檢測(cè)病毒,但這些試驗(yàn)的結(jié)果與白蛉熱病毒屬的其他血清型有交叉性,這些試驗(yàn)可用滅活抗原進(jìn)行,可用于無裂谷熱的國(guó)家。

            ELISA具有較高的可靠性和靈敏度,可利用幾種抗原檢測(cè)RVFV特異性抗體,OIE參考實(shí)驗(yàn)室建立了間接ELISA,以滅活的細(xì)胞培養(yǎng)物作為抗原,使用G蛋白—辣根過氧化物酶結(jié)合物,該試驗(yàn)較為靈敏,可于數(shù)小時(shí)檢測(cè)出RVFV抗體;用于ELISA檢測(cè)的抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清和操作程序均可以從參考實(shí)驗(yàn)室獲得。
            OIE診斷手冊(cè)上的試驗(yàn)程序如下(除非其他說明,使用的體積均為50ul/孔,所有的稀釋液用3g/100ml脫脂奶緩沖液,并且所有的洗滌進(jìn)行3次)。

            ①以預(yù)先確定的濃度分別用陽性抗原和陰性抗原包被半塊板,每孔 50ul。4℃孵育過夜。洗板。
            ②每孔加入100~L封閉液,37℃孵育1h。洗板。
            ③將待檢血清和對(duì)照血清以預(yù)先確定的濃度分別加入到陽性和陰性抗原孔中,每份兩個(gè)重復(fù)。37℃孵育1h。洗板。
            ④加人工作濃度的G蛋白—辣根過氧化物酶結(jié)合物。37℃孵育1h。洗板。
            ⑤加入提供的四甲聯(lián)苯胺底物,然后將板室溫(22℃)避光保存20min(顯色時(shí)間)。
            ⑥加入終止液(2mol/L硫酸),然后在450nm/650nm的光密度下讀板。

            Paweska等建立了間接ELISA、IgG夾心ELISA和IgM捕獲ELISA檢測(cè)裂谷熱抗體,以適應(yīng)當(dāng)前日益增長(zhǎng)的與臨床診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)因子研究相關(guān)的診斷靈敏性和特異性的可靠評(píng)估。與病毒中和試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)相比,IgG夾心ELISA在檢測(cè)裂谷熱病毒早期感染或免疫zui早的免疫球蛋白反應(yīng)時(shí)更加靈敏。從田間取得的數(shù)據(jù)表明,它的靈敏性和特異性在不同反芻動(dòng)物中分別固定在99.5%~100%和99.1%~99.9%之間。IgG捕獲ELISA的特異度在不同動(dòng)物種類中從97.4%一99.4%之間變化;它的靈敏度在綿羊感染后的5—42天是100%。

            當(dāng)然,這一疾病的診斷應(yīng)當(dāng)包括多種程序,如病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的分離,抗原的ELISA試驗(yàn),確實(shí)的PCR方法,或者通過免疫吸附試驗(yàn)或者免疫熒光試驗(yàn)來檢測(cè)病毒特異性IgG和IgM,同時(shí)這些診斷技術(shù)還應(yīng)當(dāng)與臨床癥狀、病理變化、流行病學(xué)調(diào)查等相結(jié)合。
             

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