轉(zhuǎn)眼間就到2020年了

小奧課堂又帶著滿當(dāng)當(dāng)?shù)闹R(shí)來咯

今天小奧和大家分享的依然是

干貨滿滿的生物研究實(shí)踐手冊(cè)

祝大家新年愉快！

Part 1

 —— 前 言 | 

組織gDNA提取和純化是分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其原理和操作絕大數(shù)生物學(xué)相關(guān)的研究人員都有接觸。

困擾實(shí)驗(yàn)人員的是當(dāng)樣本量過大時(shí)，以1.5ml離心管為基本體系的組織核苷酸提取模式，同時(shí)操作20個(gè)以上的樣品有非常繁瑣的實(shí)驗(yàn)過程和樣品間有錯(cuò)亂或者交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，此篇筆者介紹一種以微孔板為基本體系，借助樣品均質(zhì)器和微孔板離心機(jī)為基本體系的高通量半自動(dòng)化提取和純化體系，該體系極大的增加了研究人員的實(shí)驗(yàn)效率。

Part 2

 - 原理解析 - 

 核苷酸提取和純化的基本原理 

核苷酸提取和純化的一般過程包括裂解組織細(xì)胞，并使細(xì)胞內(nèi)的核酸酶如DNase 和 RNase失活，然后從細(xì)胞裂解液中得到核苷酸成分并分離純化出來。

在裂解組織細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞裂解液的選擇是非常關(guān)鍵的因素，商業(yè)化的裂解液有很多中不同的種類，其組分和組分的配比有非常大的不一樣，由于不同機(jī)體組織結(jié)構(gòu)的差異如植物細(xì)胞有細(xì)胞壁而動(dòng)物細(xì)胞沒有，需要選擇不同類型的裂解液來提高gDNA的提取效率。

裂解液的作用包括以下幾個(gè)方面：

1.  裂解細(xì)胞膜和核酸膜

2.  裂解液保持gDNA結(jié)構(gòu)的完整性

3.  裂解液能夠使gDNA能夠從細(xì)胞碎片中分離，并防止其被酸降解。

4.  在gDNA提取過程中保持裂解液中穩(wěn)定的PH值。

細(xì)胞裂解液的主要化學(xué)成分包括Tris, EDTA, SDS, CTAB, Triton X100, MgCl2, KCl, NaCl和其它的洗滌劑。

首先Tris, EDTA是細(xì)胞裂解液的主要成分，俗稱TE buffer, Tris能夠維持裂解液穩(wěn)定的PH值而EDTA是二價(jià)金屬離螯合劑，主要作用是使DNase 和RNase 失活； 其次，SDS和CTAB的作用是能夠裂解細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜和核膜上的蛋白質(zhì)失活，再者一些鹽類如MgCl2能夠阻斷脂蛋白的負(fù)電從而保護(hù)DNA，KCl, NaCl能夠中和負(fù)電的DNA使DNA較易從細(xì)胞中拉出來。

當(dāng)然細(xì)胞裂解時(shí)可能也會(huì)使用到Triton X100，beta-mercaptoethanol, ascorbic acid等試劑。

值得注意的是，在組織gDNA提取的過程中，通常還會(huì)采用Proteinase K蛋白酶進(jìn)行前處理，采用Proteinase K進(jìn)行DNA提取的方法到目前為止常用的DNA提取方法之一。

蛋白酶K是一種從白色念珠菌分離出來的強(qiáng)力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的關(guān)鍵試劑。該酶在較廣的pH值范圍（4-12.5）內(nèi)以及高溫（50-70攝氏度）均具有活性。EDTA等螯合劑或SDS等去垢劑均不能使之失活。

蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。蛋白酶K能夠消化細(xì)胞膜和核膜上的各種膜蛋白糖蛋白，同樣也能消化和DNA結(jié)合的組蛋白。

核苷酸的分離純化的方法有很多種，很多方法都有商業(yè)化的試劑盒提供，現(xiàn)在較為通用的是固相gDNA核苷酸分離純化的方法，包括以下幾個(gè)關(guān)鍵的步驟：

1.  細(xì)胞裂解液中的gDNA在固相表面的吸附

2.  清洗固相表面，去除固相表面非gDNA的雜質(zhì)

3.  將gDNA從固體吸附表面洗脫下來得到較純的gDNA

關(guān)于固相表面多為二氧化硅材質(zhì)，依附在柱子（column）的形式或者磁性微球（bead）的形式，帶正電的二氧化硅類材料對(duì)帶負(fù)電的DNA骨架有很強(qiáng)的結(jié)合力，鈉離子在兩者之間起到了陽離子橋的作用。

在pH小于7的情況下，高濃度的鈉陽離子打破了二氧化硅材料帶負(fù)電氧離子和水溶液氫離子的氫鍵結(jié)合，使得DNA能夠牢牢地綁在二氧化硅材料上，大量地洗滌能夠去除吸附在二氧化硅材料上地DNA以外地其他污染物。

低的離子濃度和pH大于7的情況下，DNA和二氧化硅材料表面的結(jié)合力變得十分微弱，較純的DNA可以從二氧化硅材料表面采用TE緩沖液或者單純用蒸餾水洗脫下來。

Part 3

 - 實(shí)例分享 - 

 高通量組織gDNA提取方案分享 

1. 將組織切成25mg左右的小塊（脾臟組織多10mg）放入合適的奧豪斯預(yù)填充均質(zhì)裂解管中（針對(duì)不同來源的組織裂解管中含有對(duì)應(yīng)直徑的鋯珠能夠?qū)M織進(jìn)行有效的切割），

加入0.5ml TE buffer,使用奧豪斯高通量生物樣品均質(zhì)器，設(shè)置研磨時(shí)間為5分鐘，研磨速度1500rpm，樣品過多可使用深孔板進(jìn)行裂解。

2.  裝載組織裂解液的96孔板中每孔加入10ul proteinase K(20mg/ml),混勻，56℃度下孵育1-3小時(shí)直至組織*裂解。（在孵育過程中渦流混勻效果更佳）。如果需要RNA-free的DNA樣品，在孵育完后可平衡到室溫后加入RNase消化2分鐘。

3.  根據(jù)高通量DNA試劑盒的手冊(cè)，將合適量的裂解液和乙醇加入裝載組織裂解液的96孔板中，15s混勻。

4.  96孔連接的DNA結(jié)合柱子套上深孔96孔板，將混勻后的裂解液（包括任何的沉淀物）一一對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)移到DNA結(jié)合的柱子上，用離心機(jī)將96孔板8000rpm離心一分鐘。

5.  離心后棄深孔板中的廢液，加入試劑盒提供的洗滌液500ul到DNA結(jié)合柱子，8000rpm離心一分鐘。如果洗滌液有兩種，操作兩次。

6.  離心后棄深孔板中的廢液，96孔板14,000 rpm離心3分鐘使酒精揮發(fā)。

7.  棄裝廢液的深孔板，在DNA結(jié)合柱子表面下?lián)Q上干凈的96孔板，加入100ul TE緩沖液或者微熱的雙蒸水到DNA結(jié)合柱子表面，放置2分鐘以使TE/水浸潤，8000rpm離心一分鐘。

8.  用微量分光光度儀檢測(cè)96孔板中DNA的OD值A(chǔ)260,A280和A320,得到純度和濃度信息。

Part 4

 - 展望 -  

DNA提取和純化技術(shù)有賴于目前成熟商業(yè)化的試劑盒已成為生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

但當(dāng)樣品量過大時(shí)，特別是操作難度較大的組織樣品時(shí)，以常規(guī)的1.5ml離心管為體系的gDNA提取和純化技術(shù)依舊是一個(gè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過程，需要很長的時(shí)間和體力勞動(dòng)，多批次進(jìn)行提取，這樣一個(gè)過程有極大的樣品混淆，交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。

利用現(xiàn)有的一些便利的儀器和材料如96孔板，96孔DNA結(jié)合柱，奧豪斯高通量生物樣品均質(zhì)器進(jìn)行g(shù)DNA提取和純化將整個(gè)過程變得半自動(dòng)化，將有效的規(guī)避前面描述的這些風(fēng)險(xiǎn)，是提高實(shí)驗(yàn)室gDNA提取效率和質(zhì)量的常用解決方式，也是未來gDNA提取和純化的發(fā)展方向。