Ni-Agarose  His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）說明書

6×His-Tagged Protein Purification Kit 

 目錄號(hào)：  K0893   

保    存：  蛋白酶抑制劑混合物，-20℃；  其它組分，2-8℃。 

組分說明 

Cat.No.          K0893         K0893A

Volume               2ml            5ml

Ni-Agarose 填料      2ml            5ml

細(xì)菌裂解液          25ml            65ml

尿素              145g            365g

1MTris（pH7.9）      6ml             15ml

1M  咪唑          25ml           65ml

3M 氯化鈉         50ml          125ml

蛋白酶抑制劑混合物    0.3ml          0.7ml

親和柱空柱         1個(gè)(6ml)      1 個(gè) (12ml)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

  該鎳柱純化系統(tǒng)對(duì)6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有6個(gè)組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4 個(gè)Ni2+ 螯合位點(diǎn)，較只有3個(gè)螯合位點(diǎn)的Ni-IDA 結(jié)合Ni2+更為牢固，有效防止純化過程中Ni2+脫落且增強(qiáng)對(duì) His 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力，提高純化效率。較高的基團(tuán)密度，大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下，對(duì)來 源于各種表達(dá)系統(tǒng)（如桿狀病毒，哺乳細(xì)胞，酵母以及細(xì)菌）中的 His 標(biāo)簽蛋白，均有很好的純化效果。本產(chǎn)品已螯合鎳離子，可直接用于包涵體蛋白的純化，使用方便，快捷。

支 持 物： CL-6B 瓊脂糖凝膠

載量：20-30mgHis標(biāo)簽蛋白/ml 填料  粒徑：50-160μm

注意事項(xiàng) 

1. 在純化之前采用電泳檢測(cè)蛋白的可溶性，本試劑盒只適合于包涵體蛋白的純化，如需純化可溶性蛋白，請(qǐng)選擇我公司的可溶性蛋白純化試劑盒，貨號(hào)為 k0009

2. 緩沖液中不建議使用β-巰基乙醇、DTT 和EDTA。

3. 整個(gè)純化過程中切忌凝膠脫水變干。

4. 為提高純化效率，首先確定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的*使用濃度。必要時(shí)可以使用線性或梯度濃度的咪唑（10-500mM）洗脫蛋白，并通過 SDS-PAGE 或WesternBlotting 來檢測(cè)目的蛋白的純度。

5. 請(qǐng)使用高純度的試劑配制緩沖液，并通過0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。為避免柱子被堵塞，建議將裂解液進(jìn)行離心，或者使用0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。

6. 柱再生時(shí)，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

7. 如果有些蛋白采用尿素的溶解效果不好，可以采用鹽酸胍進(jìn)行溶解。

操作步驟 

組裝層析柱 

1. 將填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

注意：（1）填料的上層是乙醇保護(hù)層，將填料和乙醇一起混勻，以每ml填料純化20-30mgHis標(biāo)簽蛋白計(jì)算，取需要的體積的填料與乙醇的混合液加入層析柱。

（2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個(gè)外力，例如用大拇指對(duì)柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。

（3）本實(shí)驗(yàn)都是通過重力作用使溶液流出。

2. 向裝填好的柱中加入5 倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用 8 倍柱體積的Binding Buffer平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。

注意：柱體積指的是填料的體積。

包涵體蛋白的純化（BindingBuffer和ElutionBuffer配方詳見附表2） 

1.  收集菌體后，每100mg菌體（濕重）加入2 ml細(xì)菌裂解液（每1ml 細(xì)菌裂解液中請(qǐng)預(yù)先加入10μl 蛋白酶抑制劑混合物），如有需要可以超聲裂解菌體。

注意：（1） 當(dāng)提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時(shí)，建議加入DNaseI和Lysozyme。每1ml 細(xì)菌裂解液中加入1μlDNaseI（1,000U/ml），2μlLysozyme（50mg/ml），DNaseI和Lysozyme可單獨(dú)從我公司購(gòu)買，貨號(hào)：Lysozyme(#YJ0887)、 DNaseI(#YJ2090A)，如使用其它公司產(chǎn)品，請(qǐng)按照相應(yīng)說明書操作。

（2）超聲過程中保持菌液處于冰浴中，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實(shí)驗(yàn)中自己摸索，應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱，可分成短時(shí)間，多次超聲，通過一定的間隔時(shí)間避免溶液過熱。終以菌液變清即可。

2.   10000×g，4℃離心15分鐘，分離上清和沉淀，并收集沉淀。

3.   將沉淀重懸于Binding Buffer中，盡量混勻使包涵體充分溶解。

4.   10,000×g離心20分鐘，收集上清。

注意：建議將離心后的上清以孔徑為0.22µm或者0.45 μm的濾膜過濾。

5. 將上清負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液。

  注意：（1）本試劑盒中附帶有一塊篩板，使用時(shí)先將篩板加至填料的上層，再將處理好的上清負(fù)載上柱。該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過濾，防止過多的雜蛋白堵塞柱子，但是篩板放入柱子后不易取出。

（2）通過控制加入的上清（菌體裂解液）的速度來控制流速。

6. 使用15倍柱體積的Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。

7. 使用適量Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。

注意：通過蛋白監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)，洗脫峰可以分管收集，每1ml收集1管。

8. 洗脫后，依次使用5倍柱體積的Binding Buffer，5倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），4℃保存。 

  注意：（1）在純化包涵體蛋白時(shí)，所有緩沖液均含有變性劑，可以降低BindingBuffer中的咪唑濃度（比5mM更低）。洗脫時(shí)，若蛋白在較高pH下洗脫失敗，可以選用低pH緩沖液作為洗脫緩沖液（pH6.5，pH5.9或pH4.5）。 

（2）如果是分段梯度洗脫，大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達(dá)到500mM，則使用濃度為500mM的咪唑進(jìn)行洗脫10倍柱體積后，再進(jìn)行第8步的操作。

柱再生 

   當(dāng)填料使用多次后，結(jié)合效率會(huì)有所下降（表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色），可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

 1. 使用2 倍柱體積的6M  鹽酸胍沖洗后，使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。

 2. 使用1 倍柱體積2% SDS沖洗。

 3. 依次使用1 倍柱體積的25%、50%、75%和5 倍柱體積100%乙醇沖洗，再依次使用 1 倍柱體積的75%、50%、25%的乙醇沖洗。

 4. 使用1 倍柱體積的去離子水沖洗。

 5. 使用5 倍柱體積含50 mM EDTA 緩沖液（PH8.0）沖洗。

 6. 使用3 倍柱體積去離子水，3 倍柱體積20%乙醇沖洗。

 7. 4°C 保存。

8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗，然后使用5 個(gè)柱體積的50mM NiSO4再生，3 個(gè)柱體積的Binding Buffer平衡。

1: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)  

（分子量由大到小分別為：90/66/45/35/27/20kDa）

2: 全菌裂解液

3: 流穿收集液

4: 洗脫收集液

附表 

                          附表  1. 包涵體蛋白純化緩沖液配方

成分       Tris-HCl（PH7.9）   咪唑    NaCl    尿素

BindingBuffer        20mM    5mM    0.5M   8M

ElutionBuffer      20mM     500mM   0.5M   8M

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