FISH技術通過熒光標記的DNA探針與細胞核內的DNA靶序列雜交。在熒光顯微鏡下觀察并分析細胞核內雜交于DNA靶序列的探針信號，以獲得細胞核內染色體(或染色體片段)上基因狀態(tài)的信息。目前進行HER2基因狀態(tài)檢測的探針多為同時含有HER2基因和該基因所在的第17號染色體著絲粒(CEPl7)序列的雙探針，也可采用僅含有HER2基因的單探針。

1．觀察程序：應在低倍鏡下觀察整張FISH切片，初步判斷檢測質量以及是否存在HER2擴增的異質性。要求至少找到2個浸潤癌區(qū)域，計數(shù)至少20個浸潤癌細胞。也可以參照IHC切片先確定可能存在擴增的浸潤癌區(qū)域，然后于100倍物鏡下通過特異通道濾光片觀察HER2和CEP17信號，并進行信號計數(shù)和比值計算。

2．結果判讀及注意事項：應選擇細胞核大小一致、核的邊界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、細胞核無重疊、信號清晰的細胞。隨機計數(shù)至少20個浸潤癌細胞核中的雙色信號。在觀察信號時，應根據(jù)情況隨時調節(jié)顯微鏡的焦距，準確觀察位于細胞核不同平面上的信號以免遺漏。判讀標準如下圖--雙探針ISH：

(1)當HER2／CEP17比值≥2.0時，為HER2陽性；HER2／CEP17比值<2.0，但平均HER2拷貝數(shù)／細胞≥6.0時也為HER2陽性。擴增細胞應均質、連續(xù)，且占浸潤癌的10％以上。需要注意的是對于HER2／CEP17比值≥2.0，但平均HER2拷貝數(shù)／細胞<4.0的病例是否應該視為ISH陽性目前尚存一定爭議。建議對這部分病例在報告中加以備注，提示目前的認識爭議，建議臨床醫(yī)師參考IHC檢測結果并與患者進行必要的溝通。

(2)HER2／CEPl7比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)／細胞<2.0時為HER2陰性。

(3)HER2／CEP17比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)／細胞<6.0，但i>4.0時為HER2 ISH結果不確定。單探針ISH：腫瘤細胞平均HER2拷貝數(shù)／細胞<4．0為無擴增；腫瘤細胞平均HER2拷貝數(shù)／細胞≥6.0為擴增。擴增細胞應均質、連續(xù)，且占浸潤癌的10％以上。平均HER拷貝數(shù)／細胞在4～6之間為不確定。若眾多HER2信號連接成簇時可不計數(shù)，直接視為基因擴增。對于ISH結果不確定的病例．需要再計算20個細胞核中的信號或由另外一位分析者重新計數(shù)。如仍為臨界值，則應行IHC檢測(若FISH前未行)，也可以選取不同的組織塊重新檢測。建議在HER2 FISH檢測報告中包括如下內容：患者信息(包括姓名、性別、年齡、門診／住院號)、送檢醫(yī)師姓名、送檢日期、標本信息(包括病理號和蠟塊號)、標本部位和類型、探針信息、檢測方法、是否使用圖像分析、對照設置情況、樣本量是否適合評估、判讀結果(包括評估的細胞數(shù)量、平均HER2拷貝數(shù)／細胞、平均CEPl7拷貝數(shù)／細胞、平均HER2拷貝數(shù)／平均CEPl7拷貝數(shù)的比值)、檢測結論(如陽性、不確定、陰性、無法判讀)。

3．質量控制：(1)內對照：使用上述同時含有HER2基因和CEPl7序列的混合探針時，組織中≥75％的細胞核顯示出雙色信號時視為雜交成功，并且雙色信號互為對照，癌與非癌細胞互為對照。出現(xiàn)下列情況時應視為FISH檢測失敗，包括：①對照樣本未出現(xiàn)預期結果；②浸潤癌病灶太小，難以觀察到兩個浸潤癌區(qū)域并計數(shù)；③可計數(shù)信號的細胞<75％；④>10％的熒光信號位于細胞核外；⑤細胞核結構難以分辨；⑥有強的自發(fā)熒光。(2)外對照：應選擇已知FISH陽性和陰性的標本片(或采用廠家提供的對照片)作為外對照，且雜交染色結果與預期相符。(3)如有可能，建議設置低擴增對照。

4．關于第17號染色體數(shù)目：FISH雙探針檢測中加入CEPl7探針的目的是為了在檢測HER2基因的同時檢測第17號染色體數(shù)目，從而將第17號染色體的非整倍體和單純的HER2基因擴增，尤其是低水平的擴增區(qū)分開。但近年來的研究顯示整條第17號染色體的多體罕見，CEP17的多體并不能代表整條第17號染色體多體。部分乳腺癌中第17號染色體存在HER2基因和著絲粒的共同擴增。越來越多的學者認為，與HER2／CEPl7比值相比，HER2拷貝數(shù)對于HER2基因擴增的判斷更為重要。因此在HER2 FISH檢測結果中除報告HER2／CEPl7比值外，還應分別報告HER2拷貝數(shù)和CEPl7的數(shù)值。

5．關于HER2基因的異質性：浸潤性乳腺癌中HER2表達或擴增可存在異質性。雖然HER2基因異質性的臨床意義目前仍不明確，但它可導致IHC與ISH檢測、原發(fā)灶與轉移灶、穿刺標本與手術切除標本的檢測結果不一致。在ISH計數(shù)之前，應觀察整張切片或使用IHC確定可能存在HER2擴增的區(qū)域。需要強調的是，即使存在異質性，但只要擴增細胞連續(xù)、均質，且占浸潤癌10％以上，就應明確報告為ISH陽性。可補充報告不同細胞群(>10％)的計數(shù)值(包括計數(shù)的細胞總數(shù)、HER2拷貝數(shù)、CEPl7數(shù)值、HER2／CEPl7比值)，并報告擴增細胞群占所有浸潤癌細胞的比例。