細(xì)胞肌酸激酶（CK）總活性酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細(xì)胞肌酸激酶（CK）總活性酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過磷酸因子和ATP能量轉(zhuǎn)換反應(yīng)系統(tǒng)中，直接測定與ATP水解對應(yīng)的ATP合成過程中，伴隨的磷酸肌酸的去磷酸反應(yīng)，進(jìn)而由己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)中，伴隨的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的還原反應(yīng)，即采用光譜法測定其還原后峰值的變化，以分析樣品中酶活性的&而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動物或人體）肌酸激酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

肌酸激酶（creatine kinase；CK），又稱為磷酸肌酸激酶（creatine phosphokinase；CPK），主要在骨骼肌、平滑肌和腦組織中表達(dá)。肌酸激酶由兩個亞基組成：B型（腦組織型）或M型（肌組織型）；構(gòu)成3個不同同功異構(gòu)酶：：CK-BB（CK-1）、CK-MB（CK-2）和CK-MM（CK-3）以及CK-Mt（線粒體型）。肌酸激酶的增高表明肌肉的損害，與機體受傷、橫紋肌溶解癥（habdomyolysis）、心肌梗塞（myocardial infarction）、肌炎（myositis）、心肌炎（myocarditis）、惡性體溫升高（malignant hyperthermia）和抗精神病藥導(dǎo)致惡性綜合癥（neuroleptic malignant syndrome）等有關(guān)。肌酸激酶的降低表明酒精性肝病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。肌酸激酶通過消耗ATP催化肌酸轉(zhuǎn)化成磷酸肌酸的反應(yīng)，產(chǎn)生ADP。在這一能量轉(zhuǎn)換反應(yīng)系統(tǒng)中，直接測定與ATP水解對應(yīng)的ATP合成過程中，伴隨的磷酸肌酸的去磷酸反應(yīng)，進(jìn)而通過己糖激酶（hexokinase）的催化，ATP磷酸化葡萄糖，產(chǎn)生6-磷酸葡萄糖（glucose-6-phosphate），繼續(xù)在6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phosphonate dehydrogenase；G6PDH）的作用下，生成6-磷酸葡萄糖酸（6-phosphogluconate；6-PG），同時氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH），其吸光峰值的變化（340nm）， 來定量測定肌酸激酶的總活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）     毫升

  裂解液（Reagent B）     毫升

  緩沖液（Reagent C）     毫升

  反應(yīng)液（Reagent D）     毫升

  陰性液（Reagent E）     毫升

  底物液（Reagent F）     毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存  反應(yīng)液（Reagent D）和  底物液（Reagent F）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離細(xì)胞

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升  裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔30秒，讀數(shù)7次（共3分鐘），并置零 
•    緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升  底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
• 加入xx微升  陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)3分鐘－340波長讀數(shù)0分鐘 

• 樣品活性測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升  底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：20微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)3分鐘－340波長讀數(shù)0分鐘

• 計算樣品活性

 注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作 
• 本產(chǎn)品檢測范圍為5至300單位/升
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)3分鐘
• 光譜測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定3分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/50微升（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 肌酸激酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 6.8的情況下，在單位時間內(nèi)（每分鐘）催化磷酸肌酸轉(zhuǎn)化為肌酸所消耗的酶量
• 本公司提供系列激酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感