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            多肽合成技術原理,多肽合成方法解讀

            來源:安諾倫(北京)生物科技有限公司   2020年05月28日 11:22  

            多肽是蛋白質水解的中間產物,是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物。由兩個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽,同理有n個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做n肽。通常把三肽以上的叫多肽。

            多肽合成以固相合成為反應原理,在密閉的防爆玻璃反應器中使氨基酸按照已知順序(序列,一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端)不斷添加、反應、合成,操作終得到多肽載體。固相合成法,大大的減輕了每步產品提純的難度。為了防止副反應的發(fā)生,參加反應的氨基酸的側鏈都是保護的。羧基端是游離的,并且在反應之前必須活化。固相合成方法有兩種,即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢,現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成,但對于某些短肽,tBoc因其產率高的優(yōu)勢仍然被很多企業(yè)所采用。

            具體合成由下列幾個循環(huán)組成:

            1) 去保護:Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去 除氨基的保護基團。

            2) 激活和交聯(lián):下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應交聯(lián),形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環(huán):這兩步反應反復循環(huán)直到合成完成。

            3) 洗脫和脫保護:多肽從柱上洗脫下來,其保護基團被一種脫保護劑(TFA) 洗脫和脫保護。

            多肽的分類

            多肽有生物活性多肽和人工合成多肽兩種。

            1、生物活性肽

            生物活性肽(Bioactive Peptides ,BAP)是對生物機體的生命活動有益或是具有生理作用的肽類化合物,是一類相對分子質量小于6000Da , 具有多種生物學功能的多肽。生物活性肽具有多種人體代謝和生理調節(jié)功能,易消化吸收,有促進免疫、激素調節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用,是當前食品界熱門的研究課題和具有發(fā)展前景的功能因子。

            2、人工合成多肽

            固相多肽合成方法(SPPS),由于其合成方便,迅速,成為多肽合成的方法,而且?guī)砹硕嚯挠袡C合成上的一次革命,并成為了一支獨立的學科——固相有機合成,固相合成的發(fā)明同時促進了肽合成的自動化。世界上真正意義上的多肽合成儀出現(xiàn)在1980年代初期。

            基于將單個N-α保護氨基酸反復加到生長的氨基成份上,合成一步步地進行, 通常從合成鏈的C端氨基酸開始,接著的單個氨基酸的連接通過用DCC,混合炭酐, 或N-carboxy酐方法實現(xiàn)。Carbodiimide方法包括用DCC做連接劑連接N-和C-保護氨基酸。重要的是, 這種連接試劑促接N保護氨基酸自己炭基和C保護氨基酸自由氨基間的縮水,形成肽鏈, 同時產出N,N?/FONT>-dyaylcohercylurea副產物。

            多肽合成方法

            1、酸酐法

            在多肽合成中,初考慮應用酸酐要追溯到1881年Theodor Curtius對苯甲?;被宜岷铣傻脑缙谘芯俊陌被宜徙y與苯甲酰氯的反應中,除獲得苯甲酰氨基乙酸外,還得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6)。早期曾認為,當用苯甲酰氯處理時,N-苯甲酰基氨基酸或N-苯甲?;呐c苯甲酸形成了活性中間體不對稱酸酐。 大約在70年后,Theodor Wieland利用這些發(fā)現(xiàn)將混合酸酐法用于現(xiàn)代多肽合成。

            目前,除該方法外,對稱酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子內形成的N-羧基內酸酐(NCA,Leuchs anhydrides)也用肽縮合。后應該提到,不對稱酸酐常常參與生化反應中的?;磻?。

            2、混合酸酐法

            有機羧酸和無機酸皆可用于混合酸酐的形成。然而,僅有幾個得到了廣泛的實際應用,多數情況下,采用氯甲酸烷基酯。過去頻繁使用的氯賈酸乙酯,目前主要被氯甲酸異丁酯所替代。

            由羧基組分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐,其氨解反應的區(qū)域選擇性依賴依賴于兩個互相競爭的羰基的親電性和(或)空間位阻。在由N保護的氨基酸羧酸鹽(羧基組分)和氯甲酸烷基酯(活化組分,例如源于氯甲酸烷基酯)形成混合酸酐時,親核試劑胺主要進攻氨基酸組分的羧基,形成預期的肽衍生物,并且釋放出游離酸形式的活性成分。

            3、酰基疊氮物法

            ?;B氮物法早在1902年就被引入到肽化學中,因此它是古老的縮合方法之一。在堿性水溶液中,除了與?;B氨縮合的游離氨基酸和肽以外,氨基酸酯可用于有機溶劑中。與其他許多縮合方法不同的是,它不需要增加輔助堿或另一等當量的氨基組分來捕獲腙酸。

            長期以來,一直認為疊氮物法是不發(fā)生消旋的縮合方法,隨著可選擇性裂解的氨基酸保護基引入,該方法經歷了一次大規(guī)模的復興。該方法的起始原料分別是晶體狀的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通過肼解相應的酯很容易得到。

            4、對稱酸酐法

            Nα-酰基氨基酸的對稱酸酐是用于肽鍵形成的高活性中間體。與混合酸酐法多肽合成相反,它與胺親核試劑的反應沒有模棱兩可的區(qū)域選擇性。但肽縮合產率高,為50%(以羧基組分計)。

            雖然由對稱酸酐氨解形成的游離Nα-?;被峥梢院湍繕穗囊黄穑ㄟ^飽和碳酸氫鈉溶液萃取回收,但在初,這種方法的實用價值極低。對稱酸酐可以用Nα-保護氨基酸與guang氣,或方便的碳二亞胺反應制得。兩當量的Nα-保護氨基酸與-當量的碳二亞胺反應有利于對稱酸酐的形成,對稱酸酐可以分離出來,也可不經純化而直接用于后面的縮合反應?;贜α-烷氧羰基氨基酸的對稱酸酐對水解穩(wěn)定,可采用類似上述純化混合酸酐的方法進行純化。

             

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