當(dāng)我們做免疫熒光的實驗時，市面上會有很多的染料供我們選擇，讓人眼花繚亂，那到底應(yīng)該如何選擇呢？讓我們看看以下介紹

一、熒光標(biāo)記是什么？

熒光標(biāo)記就是用熒光基團(tuán)特異性來標(biāo)記細(xì)胞或者組織樣品中所感興趣的區(qū)域。一般常用的熒光標(biāo)記方法有表達(dá)熒光蛋白、細(xì)胞器及DNA特異性染料、抗體偶聯(lián)免疫熒光染料和雙光子熒光染料等。

 1）活細(xì)胞熒光標(biāo)記選擇——熒光蛋白

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，簡稱GFP)，是一個由約238個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，從藍(lán)光到紫外線都能使其激發(fā)，發(fā)出綠色螢光。在研究中，我們可以將外源基因與GFP DNA進(jìn)行相連，GFP可以作為外源基因的報告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達(dá)，對活細(xì)胞中的目的蛋白進(jìn)行精準(zhǔn)定位和動態(tài)觀察。后來GFP經(jīng)過科學(xué)家的改造，衍生出五顏六色的熒光蛋白。

GFP圖像

 2）免疫熒光染料

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。對于表達(dá)量高的蛋白，可以在一抗上直接連接熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，稱之為直接標(biāo)記法。然而大部分樣品我們都是采用一抗二抗兩步的間接標(biāo)記法進(jìn)行信號放大，提升反應(yīng)靈敏性。

免疫熒光圖片

二、具體該如何選擇熒光染料？

（1）熒光亮度：熒光亮度越高，所需的激發(fā)光亮度就更低，可以使用更低的曝光時間進(jìn)行拍攝。也可以減少光漂白及光毒性。

（2）光穩(wěn)定性：熒光基團(tuán)的光穩(wěn)定性即抗漂白能力，越穩(wěn)定熒光越不容易淬滅。

（3）熒光濾光片：熒光染料的選取還要考慮設(shè)備本身具有的熒光濾光片，我司提供美國Omega專業(yè)熒光濾光片，幫助您完成不同染料的實驗。

常見的熒光染料
 

細(xì)胞器及DNA熒光染料

實驗中，常常需要對線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器以及DNA進(jìn)行染色。

? 線粒體

觀察線粒體經(jīng)常用的染料就是MitoTracker，它是一種可以透過細(xì)胞的染料，有不同的顏色和修飾類型可供選擇。

▲藍(lán)色為DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，綠色為Alexa Fluor 488標(biāo)記細(xì)胞微管，紅色為MitoTracker Red標(biāo)記的線粒體

? 細(xì)胞核

標(biāo)記細(xì)胞核的染料常用的是DAPI 358/461 nm和Hochest 350/460 nm。
區(qū)別是DAPI標(biāo)記半通透細(xì)胞，能夠穿透細(xì)胞膜，可以用于固定和活細(xì)胞之中。Hochest染色劑毒性相對較低，比較適合標(biāo)記活細(xì)胞。

▲DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，

三、如何選擇熒光觀察工具

常用的熒光觀察工具就是熒光顯微鏡了，而其中對于熒光效果重要的組件就是熒光濾光片，它的好壞決定了終成像的質(zhì)量及效果，我們使用美國Omega光學(xué)專為顯微熒光應(yīng)用設(shè)計的熒光濾光片，擁有50年的研發(fā)設(shè)計經(jīng)驗，效果優(yōu)于市面上常用的標(biāo)配產(chǎn)品，極大的提高了熒光效果。

高透過率使熒光更亮、高截止使背景噪音更低，終實現(xiàn)更好的信噪比效果

科研級熒光顯微鏡

1、全新一代無限遠(yuǎn)色差校正光學(xué)系統(tǒng)：日本專家設(shè)計進(jìn)口材料制作的多功能無限遠(yuǎn)平場半復(fù)消熒光物鏡，提供清晰明亮、背景黑暗的高分辨率熒光圖像；

2、采用德國OSRAM（歐司朗）超高壓汞燈：配有全數(shù)字式電源控制系統(tǒng)，安全、高效；

3、采用美國進(jìn)口OMEGA 專業(yè)熒光濾光片系統(tǒng)：品質(zhì)展示出色性能：標(biāo)配UV\B\G（藍(lán)、綠、紅）三種標(biāo)準(zhǔn)濾光塊組，同時可以根據(jù)客戶實際應(yīng)用選配各種對應(yīng)的濾光塊組，達(dá)到真正完美匹配，效果。常見應(yīng)用包括：M-FISH、鈣離子測定、上轉(zhuǎn)換、雙光子、多色同時顯示

4、采用Sony科研級彩色制冷圖像芯片：1英寸超大靶面，2000萬超高像素、高分辨率，高傳輸速度，高敏感度，幫您捕捉微弱的熒光信號。

5、全中文專業(yè)智能熒光圖像處理軟件：實現(xiàn)圖像的采集，處理以及測量以及熒光合成。