內(nèi)毒素致病性

Pfeiffer于十九世紀首先提出“內(nèi)毒素”一詞，研究表明，內(nèi)毒素在機體內(nèi)作用于單核巨噬細胞產(chǎn)生多種細胞因子（腫瘤壞死因子TNF，白細胞介素IL，干擾素Interferon，凝血素等）。當這些因子在機體內(nèi)過量時，則可導致機體出現(xiàn)發(fā)熱、低血壓、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。

因此，人和動物的注射藥物、生物制品和醫(yī)療器械的終端產(chǎn)品中的內(nèi)毒素的檢測和去除顯得尤為重要。

內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的一部分，其主要成分為脂多糖（LPS），經(jīng)細菌細胞裂解后釋放出來。LPS可以分為三個不同的結(jié)構(gòu)域：特異性O鏈、核心寡聚糖和類脂A，如下圖所示：

內(nèi)毒素特性

• 性質(zhì)穩(wěn)定：160℃的溫度下加熱2-4個小時，或用強堿、強酸或強氧化劑加熱煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。
• 經(jīng)甲醛溶液處理后，可降低其毒性，但不能成為類毒素。

• 中國藥典（CP）規(guī)定，藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：

  L=K/M 

  式中L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示；

  K為人每公斤體重每小時大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg• h)表示，注射劑K=5 EU/(kg• h)，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg• h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg• h)；

  M為人用每公斤體重每小時大劑量，以ml (kg• h)、mg(kg• h)或U/(kg• h)表示，人均體重按60 kg計算，人體表面積按1.62 m2計算，注射時間若不足1小時，按1小時計算。

  按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。

   

  美國藥典（USP）規(guī)定，非經(jīng)腸道藥品的內(nèi)毒素限值，以劑量定義，等于：K/M。

  除了鞘內(nèi)給藥以外的任何給藥途徑，K均為5 USP-EU/kg，鞘內(nèi)給藥時，K為0.2 USP-EU/kg，對于非鞘內(nèi)給藥放射性藥品，內(nèi)毒素限值的計算為175/V，V為以ml為單位的大推薦劑量，對于鞘內(nèi)給藥的放射性藥品，其內(nèi)毒素限值為14/V，對于按以每平方體表面積計算的給藥劑量（通常是抗腫瘤藥品），計算公式為K/M，其中K=5 EU/kg，M為(大劑量/m2/小時×1.80m2)/70kg。

  檢測方法的建立：

  1968年，由Leivin和Bang發(fā)現(xiàn)并建立了利用鱟試劑檢測細菌內(nèi)毒素的方法。他們發(fā)現(xiàn)，當遇到內(nèi)毒素時，鱟的血液能夠凝結(jié)成塊。用鱟血液中的變形細胞提取物與待檢樣品混合，如果待檢樣品中含有內(nèi)毒素，則會觀察到上述情況。鱟試驗法（LT）已經(jīng)替代了熱原檢查家兔法檢驗藥品中的內(nèi)毒素。

  目前FDA已經(jīng)批準了以下LAL檢測法：凝膠法（ToxinSensorTM凝膠法內(nèi)毒素檢測試劑盒）、濁度法和顯色法（ToxinSensorTM顯色法LAL內(nèi)毒素檢測試劑盒）。

  半定量測定——凝膠法

  通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理來半定量內(nèi)毒素的方法，是各國藥典細菌內(nèi)毒素檢查的方法。

  定量測定——濁度法和顯色法

  濁度法（動態(tài)濁度法和終點濁度法）是通過鱟試劑與內(nèi)毒素反應過程中的濁度變化來測定內(nèi)毒素含量的方法。終點濁度法是基于細菌內(nèi)毒素濃度和反應混合物的終點濁度( 吸收度或透光率) 之間的定量關系的一種檢測方法；動態(tài)濁度法（又稱動態(tài)比濁法）是檢測反應混合物的濁度上升某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。

  顯色法（動態(tài)顯色法和終點顯色法）是將鱟試劑與內(nèi)毒素反應，可使特定底物顯色，通過釋放出的呈色團的多少來測定內(nèi)毒素含量，又稱為比色法。終點顯色法是依據(jù)反應混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動態(tài)顯色法是檢測反應混合物的色度達到某一預先設定的吸光度所需要的反應時間, 或檢測色度增長速度的方法。

   

  內(nèi)毒素檢測方法的選擇：

  凝膠法——僅需檢測樣品的內(nèi)毒素*。此法操作比較簡單、經(jīng)濟，不需要測定設備，可進行定性或半定量測定。

  顯色法（或濁度法）——定量測定樣品中內(nèi)毒素含量。

• 日常檢測量不大時，可以選擇終點顯色法，用普通的分光光度計就可完成實驗。
• 檢測的樣品是生物制品、疫苗、血液制品等選用終點顯色法或動態(tài)顯色法。
• 檢測量比較大，檢測的樣品對鱟試劑的干擾不大，可選用動態(tài)濁度法鱟試劑。

• 注：動態(tài)濁度法與動態(tài)顯色法需要帶溫育系統(tǒng)的動態(tài)光度測定儀器及配套軟件。

                             華雅思創(chuàng)生物提供定量和定性產(chǎn)品如下：

• 凝膠定性：

• LONZA 凝膠法鱟試劑檢測法：

• 品牌	產(chǎn)品描述	貨號	靈敏度EU/mL	包裝
  LONZA	PYROGENTTM Plus 凝膠法鱟試劑檢測（含對照），單管內(nèi)毒素對照品1x1mL24次，單管	N289-06	0.06	24次
  		N289-125	0.125
  		N289-25	0.25
  LONZA	PYROGENTTM Ultra 凝膠法鱟試劑檢測（含對照） 內(nèi)毒素對照品5x5mL 200次=4X50次/管	N594-03	0.03	200次
  		N594-06	0.06
  		N594-125	0.125

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  顯色法或濁度定量法： 品牌 貨號 產(chǎn)品描述 靈敏度EU/mL 包裝 LONZA N383 PYROGENTTM -5000動態(tài)濁度法檢測 0.01-100 100次 LONZA N384 200次 LONZA 50-650U Kinetic-QCLTM 動態(tài)顯色法鱟試劑檢測 0.005-50 192次 LONZA 50-640 PyroGeneTM 重組因子C熒光法內(nèi)毒素檢測試劑 0.005-5 192   輔助試劑耗材：  品牌 貨號 產(chǎn)品描述 包裝 LONZA N186 凝膠法內(nèi)毒素對照品（E.Coli Strain 055：B5) 5瓶 LONZA E50-640 終點顯色法內(nèi)毒素標準對照品（Strain 0111：B4) 1瓶 LONZA W50-640 無內(nèi)毒素水，靈敏度＜0.005 EU/mL 30mL LONZA W50-100 100mL LONZA W50-500 500mL LONZA N207 13X100mm無內(nèi)毒素玻璃稀釋管，箔紙包裝，無瓶蓋 50/包   買試劑，找華雅，更多生物試劑，就在華雅思創(chuàng)！ 歡迎關注關注：華雅思創(chuàng)生物！