狠狠色丁香久久综合婷婷亚洲成人福利在线-欧美日韩在线观看免费-国产99久久久久久免费看-国产欧美在线一区二区三区-欧美精品一区二区三区免费观看-国内精品99亚洲免费高清

            產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學(xué)|元素分析|水分測(cè)定儀|樣品前處理|試驗(yàn)機(jī)|培養(yǎng)箱


            化工儀器網(wǎng)>技術(shù)中心>其他文章>正文

            歡迎聯(lián)系我

            有什么可以幫您? 在線咨詢

            干貨分享--WB實(shí)驗(yàn)問(wèn)題總結(jié)與處理方案(一)

            來(lái)源:西安昊興生物科技有限公司   2021年07月27日 15:10  

            Western blot實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題匯總及處理方案。

             

            1western blot 的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)

            答: 優(yōu)點(diǎn):靈敏,特異性高,常規(guī)可達(dá)ng級(jí),Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級(jí)。

                 缺點(diǎn):通量有限。

             

            2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有目標(biāo)蛋白?

            答: 原因有很多:首先排除WB過(guò)程是不是抗體的問(wèn)題,重新實(shí)驗(yàn)、更換抗體;其次排除蛋白是否降解,提取的時(shí)候需要加入蛋白酶抑制劑, a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì),換一種細(xì)胞;最后考慮此種細(xì)胞是否表達(dá)該蛋白,表達(dá)量高低。

             

            3、提取液有的有沉淀,有的很清亮,為什么呢?

            答: a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻](méi)有變性*,可以適當(dāng)提高SDS 濃度,同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng), b) 也不排除你的抗原濃度過(guò)高,這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。

             

            4、蛋白質(zhì)分子量很?。?/span>10KD),WB實(shí)驗(yàn)過(guò)程該注意哪些問(wèn)題?

            答:可以選擇0.2μmPVDF膜,同時(shí)縮短轉(zhuǎn)膜時(shí)間。

             

            5、目的條帶很弱,如何加強(qiáng)?

            答:可以加大抗原上樣量,這是最主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。

             

            6、膠片背景很臟,解決方法?

            答:減少抗原上樣量,降低一抗?jié)舛?,改變一抗孵育時(shí)間,提高封閉時(shí)間。

             

            7、目標(biāo)帶是空白,周圍有背景,是為什么?

            答:你的一抗?jié)舛容^高,二抗上HRP 催化活力太強(qiáng),同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn),反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng),將周圍底物催化完,形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?,或更換新底物。

             

            8、我的膠片是一片空白,是怎么回事?

            答:如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。

            a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng),將底物消耗光;

            b) ECM底物中H2O2,不穩(wěn)定,失活;

            c) ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置;

            d) 二抗失活。

             

            9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

            答:a) 可能膠片被曝光了,可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.b) 顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

             

            10、DAB好還是ECM好?

            答:DAB 有毒,但是比較靈敏,是HRP 最敏感的底物;ECM結(jié)果容易控制,但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn),但如果達(dá)到閥值,就特別靈敏,可以檢測(cè)pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。

             

            11、抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大,是怎么回事?

            答:a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量,煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng),可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如:糖基化,磷酸化等。

             

            12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上,但膠上有,同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了,為什么?

            答:可能是:a)樣品濃度過(guò)低;b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。

             

            13、磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等?

            答:NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,一般最好加。但是不加也可以,大部分時(shí)候是不用加的。

             

            14、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在,需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎?做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎?

            答: 免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位,但是不能精確定量,而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性,不易與背景區(qū)分;Western blot可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子,進(jìn)行定量,但是不能定位。

            兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用,公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn),在免疫組化時(shí),是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

             

            15、做Western Blot時(shí),提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑),用的博士德的一抗,開始還有點(diǎn)痕跡,現(xiàn)在越來(lái)越差,上樣量已加到120μg,換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?

            答:懷疑是樣品問(wèn)題,可能是:

            1,樣品不能反復(fù)凍融;

            2,樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí),建議檢查Western Blot過(guò)程, 提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō),一般加PMSF就可以了,最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

             

            16、細(xì)胞水平要做western blot,多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot?

            答:一般5×10^6就足夠了。

             

            17、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么?這樣對(duì)western blot有無(wú)影響?

            答:能,沒(méi)有問(wèn)題。有商品化的試劑盒可以滿足。

             

            18、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎?

            答:當(dāng)然可以,有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。

             

            19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要注意什么?

            答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑要溫和得多,這時(shí)最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

             

            20、我的樣品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上,就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在,只是顏色變淡了,有什么辦法可以解決?

            答:你可以加大上樣量,沒(méi)有問(wèn)題,還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間,加20%甲醇。


            免責(zé)聲明

            • 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
            • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
            • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題,請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
            企業(yè)未開通此功能
            詳詢客服 : 0571-87858618