1、用預熱過的 PBS 對細胞進行沖洗，棄去 PBS 后，加入含 EDTA 的胰酶消化液對細胞進行消化（消化液薄薄地覆蓋細胞表面即可，消化液濃度須根據不同的細胞系進行調整）。

 2、37℃消化細胞 3–5 分鐘，不可過度消化。 

 3、一旦細胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化，并用吸管輕輕吹打以重懸細胞。 

4、離心（500 × g, 5 min）細胞重懸液以沉淀細胞，棄上清，用含血清培養(yǎng)基對細胞沉淀進行重懸。 

5、對細胞進行計數（推薦 Neubauer chamber）。 

6、離心（500 × g, 5 min）細胞重懸液，棄上清。用適當體積含血清培養(yǎng)基重懸細胞。 

7、將細胞重懸液以 1:1 比例與凍存液（60% 培養(yǎng)基，20% FCS，20% DMSO） 進行混合后轉移至 Cryo.sTM 凍存管中。凍存管中細胞的濃度應為 1–5 ×10^6細胞/ml。 

8、含有細胞的凍存管須按照 −1 K/min 的冷卻速率進行冷凍。將凍存管插在含異丙醇的凍存盒小室并放置在−70℃的冰箱中可以實現(xiàn)上述要求。如果 凍存液中含有其他類型的樣品時，則需要將 Cryo.s 凍存管在−20℃，−70℃或者液氮的氣相層進行直接凍存。為確保每個樣品的均一凍存效 果，4 ml 和 5 ml 的 Cryo.s凍存管需在−20℃過夜凍存后再轉移至 70℃或者液氮的氣相層。  

9、然后將 Cryo.s 凍存管轉移至液氮罐。為避免污染（例如支原體）并考慮到安全預防規(guī)范的要求，建議將 Cryo.s 凍存管放置在液氮上方的氣相層而非液氮層。 

1、從液氮罐中取出凍存管后立即將其置于 37℃水浴中進行解凍，解凍時間約 1–2min，解凍時需要不停搖動凍存管令其盡快融化。此步解凍過程越快越好。 

2、將解凍好的細胞懸液轉移到 15 ml 離心管，并立即添加一定量含血清培養(yǎng)基進行混合。 

3、離心（500 × g, 5 min）細胞重懸液，棄去上清。用適當體積的含血清培養(yǎng)基對細胞沉淀進行重懸后分裝到 1 個或多個細胞培養(yǎng)瓶中。 

4、請遵循細胞接種時的推薦濃度進行培養(yǎng)。 

5、接下來的 12 個小時細胞需要靜置培養(yǎng)。 

6、細胞換液可在 24–48h 后進行。