人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT表達(dá)實時定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT表達(dá)實時定量檢測試劑是一種旨在運用SYBR綠色熒光染料作為標(biāo)記信號，既方便、快速地進(jìn)行各種DNA模板的擴增，又實時檢測和定量分析擴增產(chǎn)物，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。廣泛應(yīng)用于腫瘤、衰老等研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量準(zhǔn)確，重復(fù)性強，效果滿意，質(zhì)量保證。

技術(shù)背景

人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase；hTERT），又稱hTRT、hTCS1 和hEST2，是端粒酶的核心結(jié)構(gòu)，即催化亞體（catalytic subunit）。hTERT的功能性表達(dá)是端粒酶獲得活性的前提。hTERT可以激活端粒酶，使細(xì)胞獲得永生化。hTERT是端粒酶活性的限速決定成分，其mRNA表達(dá)水平與端粒酶活性之間具有密切的相關(guān)性。hTERT是一單拷貝基因，定位于5q15.33，屬于逆轉(zhuǎn)錄酶家族，具有進(jìn)化上的保守性，序列總長約35kb，由16個外顯子和15個內(nèi)含子組成。端粒酶特異性T-motif和7個同源保守序列的RT-motif分別位于不同的外顯子上。hTERTmRNA 還有7種不同的剪切轉(zhuǎn)錄本，分為缺失型與插入型兩類。

產(chǎn)品內(nèi)容

  引導(dǎo)液（Reagent A）            微升  

  逆轉(zhuǎn)液（Reagent B）                微升

  補充液（Reagent C）         毫升

  反應(yīng)液（Reagent D）         微升

  內(nèi)參液（Reagent E）         微升

  染色液（Reagent F）         微升

  封隔液（Reagent G）         毫升

產(chǎn)品說明書            1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；  染色液（Reagent F）避免光照，有效保證6月

用戶自備

RNA樣品：用于逆轉(zhuǎn)錄擴增的模板

PCR管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽或干式恒溫儀：用于反應(yīng)孵育

微型臺式離心機：用于沉降反應(yīng)物

熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應(yīng)

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑和用戶自備的總RNA樣品置入冰槽里融化；同時將干式恒溫儀分別設(shè)置到70℃和37℃。然后進(jìn)行下列操作。

一、cDNA合成

1． 分別將融化的試劑盒里的試劑溶液渦旋震蕩2秒

2． 放進(jìn)微型臺式離心機瞬時離心5秒

3． 移出xx微升  引導(dǎo)液（Reagent A）到新的0.5毫升PCR管

4． 加入8微升用戶自備的RNA樣品（1微克總RNA樣品）

5． 用槍頭混勻

6． 放進(jìn)70℃干式恒溫儀孵育3分鐘

7． 即刻放進(jìn)冰槽里

8． 加入xx微升  逆轉(zhuǎn)液（Reagent B）

9． 用槍頭混勻

10． 放進(jìn)微型臺式離心機瞬時離心5秒

11． 放進(jìn)37℃干式恒溫儀孵育60分鐘

12． 即刻放進(jìn)冰槽里

13． 加入xx微升  補充液（Reagent C）稀釋，混勻

14． 置入冰槽里備用或放進(jìn)－20℃冰箱里保存

二、實時定量PCR

1． 一次反應(yīng)總量為25微升

2． 分別移取xx微升  反應(yīng)液（Reagent D）和  內(nèi)參液（Reagent E）到2個0.5毫升PCR管，并做好標(biāo)記

3． 分別加入2微升已知cDNA合成物（注意：可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；參見注意事項9）

4． 分別加入xx微升  染色液（Reagent F）

5． 分別加入xx微升  補充液（Reagent C）到總量25微升

6． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒

7． 使用1000微升槍頭加入xx滴  封隔液（Reagent G）（注意：參見注意事項12）

8． 即刻放進(jìn)熒光定量PCR儀

9． 熒光定量PCR反應(yīng)程序為：

10． 采集數(shù)據(jù)，進(jìn)行溶解曲線分析

11． PCR產(chǎn)物置于－20℃保存?zhèn)溆?/span>

12． 或進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的特異性：hTERT片段為120bp；內(nèi)參GAPDH片段為150bp

三、表達(dá)計算

表達(dá)量：定義為相對于正常對照樣品的hTERT表達(dá)水平

GAPDH：內(nèi)參，作為調(diào)節(jié)樣品水平的參考指標(biāo)

對照：用戶可以使用hTERT低表達(dá)的正常細(xì)胞或組織作為比較對照，建議使用正常淋巴細(xì)胞

注意事項

1. 本產(chǎn)品為50次操作（包括50次cDNA合成，100次實時定量擴增）

2. 操作時，須戴手套

3. 本產(chǎn)品適合各種熒光定量PCR儀

4. 建議整個操作在4℃下進(jìn)行

5. 必須使用帶濾芯的槍頭

6. 所有器皿、離心管、液體等無RNA酶污染

7. 使用時，避免污染母液

8. 建議選用正常淋巴細(xì)胞作為正常對照或校正對照，以此作為評價hTERT的參考指標(biāo)；用戶可以選用任何其它正常細(xì)胞或組織，例如腫瘤組織旁的正常組織等

9. 建議選用hTERT陽性表達(dá)的MCF7細(xì)胞作為陽性對照，以此構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱坐標(biāo)（Y軸）為Ct值，橫坐標(biāo)（X軸）為已知細(xì)胞量對數(shù)值或拷貝數(shù)或RNA量等，其*有效用量作為樣品檢測量的標(biāo)準(zhǔn)

10. 建議使用無模板作為陰性對照

11.   內(nèi)參液（Reagent E）為看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH）作為比較分析時樣品測試用量校正統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)

12. 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入  封隔液（Reagent D）

13. 配制完成后，即刻進(jìn)行擴增反應(yīng)，以確保反應(yīng)物的活性

14. 試劑避免反復(fù)凍融

15. PCR擴增反應(yīng)的最初3個循環(huán)為定量基線；3至15個循環(huán)的熒光信號的10倍值為熒光閾值；熒光信號達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)為Ct值（參考圖像如下）

16. Ct值可以作為hTERT表達(dá)的計量單位，也可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換為表達(dá)分子數(shù)進(jìn)行計量

17. 本公司提供系列端粒酶活性檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染