狠狠色丁香久久综合婷婷亚洲成人福利在线-欧美日韩在线观看免费-国产99久久久久久免费看-国产欧美在线一区二区三区-欧美精品一区二区三区免费观看-国内精品99亚洲免费高清

            產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學|元素分析|水分測定儀|樣品前處理|試驗機|培養(yǎng)箱


            化工儀器網(wǎng)>技術(shù)中心>行業(yè)標準>正文

            歡迎聯(lián)系我

            有什么可以幫您? 在線咨詢

            細胞復蘇的原則:慢凍速融

            來源:上海遠慕生物科技有限公司   2021年09月23日 09:35  

            必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃,使細胞外凍存時的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶,對細胞造成損害。

            細胞復蘇步驟

            一.實驗前準備:
            將水浴鍋預熱至37℃。
            細胞實驗室進行常規(guī)消毒,用75%酒精擦拭并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面。
            在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等。

            二.取出凍存管:
            根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。
            從液氮罐中取出細胞盒,取出所需的細胞,同時核對管外的編號。

            三.迅速解凍:
            迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中解凍,并要不斷地搖動,使管中的液體迅速融化。
            約1-2min后凍存管內(nèi)液體*溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內(nèi)。

            四.平衡離心:
            用架盤天平平衡后,放入離心機中1000r/min,離心5min。

            五.制備細胞懸液:
            吸棄上清液。
            向離心管內(nèi)加入10ml預熱的培養(yǎng)液,吹打制成細胞懸液。
            用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞,調(diào)整細胞濃度,放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

            六.細胞計數(shù):
            細胞濃度以5×105/ml為宜。

            七.培養(yǎng)細胞:
            將符合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi),將培養(yǎng)瓶放入37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(或者24-48小時)后換液繼續(xù)培養(yǎng),換液的時間由細胞情況而定。

            八. 記錄復蘇日期:
            細胞凍存和復蘇是細胞培養(yǎng)技術(shù)里面容易出問題的部分,因此必須注意以下幾點~

            注意無菌操作。
            取細胞的過程中可能會接觸液氮,一定注意帶好防凍手套,護目鏡。
            此項尤為重要,如果凍存管密封不嚴,細胞凍存管可能漏入液氮,解凍時,在水浴中搖晃,凍存管中的氣溫急劇上升,可導致爆炸,所以,一定要戴保護眼鏡和手套,復蘇過程中應(yīng)蓋上恒溫水浴鍋的蓋。
            應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液*融化。如果復溫速度太慢,則會造成細胞損傷。另外,細胞復蘇后的操作Hao在4℃冰浴中進行,以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。
            復蘇過程中,升溫的速率要大,把從液氮取出的細胞在短的時間內(nèi)放入水浴鍋。
            離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度,以減少對細胞的損傷。

            細胞貼壁少的問題:教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml-15ml培養(yǎng)液,經(jīng)驗總結(jié),培養(yǎng)基越少細胞越容易貼附。
            復蘇細胞分裝的問題:復蘇1管細胞一般根據(jù)情況可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中,分裝過多,細胞濃度過低,不利于細胞的貼壁。
            加培養(yǎng)基的量放入問題:這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度,從如果加培養(yǎng)基的太少,DMSO的濃度就會比較大,就會影響細胞生長,從以前的資料來看,DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵毎麤]有什么影響。還有一個說法是1%。所以如果凍存液的濃度是10%DMSO,那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。

            初學者易犯的錯誤:
            水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃直接融化。
            水浴鍋內(nèi)凍存管太多,導致傳熱不佳,使融化時間延長。
            離心前忘記平衡,導致離心機損壞和細胞丟失。
            一次復蘇細胞種類過多,忘記更換吸頭和吸管,導致細胞交叉污染。
            解凍后的細胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因為每一種細胞都有自己特定的,并且已經(jīng)熟悉了的生長環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清,會造成細胞生長不良,甚至死亡,像水土不服一樣。

            結(jié)果分析:
            判斷細胞復蘇成功與否,需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率(細胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細胞,用臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞,活細胞不著色。用細胞計數(shù)板和計數(shù)器計數(shù)細胞,得出細胞存活率)。如果復蘇后95%以上的細胞貼壁,而且細胞的活性好,這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長,達到正常的生長特性(比如細胞群體倍增時間等)后要再凍存以補充細胞儲存數(shù)量。

            免責聲明

            • 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責任。
            • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負責,不承擔此類作品侵權(quán)行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負版權(quán)等法律責任。
            • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
            企業(yè)未開通此功能
            詳詢客服 : 0571-87858618