提取的核酸濃度太低,滿足不了下游實(shí)驗(yàn)要求咋辦?
我們?cè)谶M(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候,通常會(huì)對(duì)生物大分子的濃度有一定的要求,比如您要進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),加入細(xì)胞的質(zhì)粒濃度要求在1 µg/µl,這樣才能得到比較高的轉(zhuǎn)染效率??墒悄樘岬馁|(zhì)粒濃度只有200 ng/µl,這時(shí)候該怎么辦呢?如何將質(zhì)粒濃度濃縮到理想的濃度呢?
常用的方法有兩種:乙醇沉淀法和離心濃縮法。
乙醇沉淀法:
操作步驟:
1. 估算含有質(zhì)粒溶液的體積V,加入V/9體積的3M NaAc ,使得NaAc終濃度為0.3M
2. 加入2倍體積的冷無水乙醇,冰上或者-20℃孵育20min
3. 最大離心速度(>13000rpm)離心10min,棄去上清
4. 用75%乙醇洗滌2次
5. 室溫晾干
6. 加入適當(dāng)體積的水或TE buffer 溶解即可
(以上步驟來自分子克隆)
經(jīng)過一系列的復(fù)雜操作,再去做一下核酸定量檢測(cè),你往往會(huì)發(fā)現(xiàn),濃度比理想的要低很多!這是因?yàn)樵谡麄€(gè)過程中比較容易產(chǎn)生核酸的損失,比如乙醇沉淀步驟沒有將核酸*析出、離心步驟沒有*將核酸*離心下來、去除上清時(shí)不小心將核酸吸出等。
離心濃縮法:
原理:借助于真空離心濃縮儀,將待濃縮的核酸樣品放入離心機(jī)中,用真空泵提高離心機(jī)中的真空度,在低壓下核酸溶液的沸點(diǎn)降低,在室溫下即可快速揮發(fā)以達(dá)到濃縮核酸溶液的目的。
操作步驟:
1. 將樣品管放入離心機(jī)中
2. 設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速、時(shí)間,點(diǎn)擊運(yùn)行
3. 打開真空泵
4. 濃縮結(jié)束后取出樣品即可
采用離心濃縮法具有更大的優(yōu)勢(shì):
1. 操作簡單,避免復(fù)雜操作帶來樣品損失及污染
2. 濃縮速度快,100µl的待濃縮樣品濃縮至20µl大約需要40min
3. 成功率高,整個(gè)過程核酸分子均在EP管中,避免核酸損失
4. 更好的保護(hù)核酸,常溫低壓下進(jìn)行核酸濃縮,避免核酸降解
因此,離心濃縮法越來越受到用戶的青睞!
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