人們合成與生物相關的物質(zhì)是從尿素開始的，1828年，德國化學家維勒人工合成了存在于生物體的這種有機物。在1960年我國科學家采用化學方法shou次成功地合成了具有生物活性的蛋白質(zhì)——胰島素。隨著內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程技術的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)用各種不同的載體在原核、真核系統(tǒng)中進行蛋白表達更為行之有效。而這其中大腸桿菌表達系統(tǒng)發(fā)展得最為迅速、成熟。原核表達具有操作方便、快捷，需時較短，表達量大，適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。雖然也有缺少糖基化和表達后加工等問題，當有了其它多種表達系統(tǒng)后，原核系統(tǒng)仍是我們合成外源蛋白的shou選。

    在網(wǎng)上看到有人把原核表達技術分成四個等級：初次嘗試掃盲、亂棍打棗入門、系統(tǒng)優(yōu)化中級和自成一體高手，覺得十分有意思。但是根據(jù)筆者自己的經(jīng)驗以及耳聞目睹的一些經(jīng)歷告訴我：做表達？那是謀事在人，成事在天。有時候你把克隆做出來了，雙酶切鑒定沒問題，測序沒問題，可是就是看不到表達帶。原因當然可以分析，實驗也是可以改進，但是竄改一下戈爾泰的話：“成功的實驗都是一樣的，失敗的實驗各有各的不幸?！痹趯嶒炗龅狡款i的時候要如何進行分析，找到問題的癥結(jié)是我們的實驗關鍵所在。在準備進行原核表達的時候需要考慮的因素很多，市面上可供選擇的載體、菌株也很多，要如何進行正確的選擇，找到適合自己的載體是十分重要的。所以，現(xiàn)在要對目前常用的一些載體進行介紹，讓我們對其相關產(chǎn)品及其表達原理進行了解，以方便實驗設計。

    首先來一些大腸桿菌表達的基本概念：一個完整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株，如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗目的來考慮，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結(jié)在表達載體的選擇上。

表達載體：我們關心的質(zhì)粒上的元件包括啟動子，多克隆位點，終止密碼，融合Tag（如果有的話），復制子，篩選標記/報告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實驗室之間交換得到免費的載體。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景？MCS是否還是原來那個MCS？是我們要特別注意的。

復制子：通常表達載體都會選用高拷貝的復制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴謹方式復制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復制子的拷貝數(shù)高達500以上，是表達載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達量是非線性的正相關，當然也不是越多越好，超過細胞的承受范圍反而會損害細胞的生長。如果碰巧需要2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復制元是否相容的問題。

篩選標記和報告基因：氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標記，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一個載體的篩選標記用。四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微?？剐曰虻倪x擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達篩選中要注意的問題應該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導致抗生素失效。今天耐青霉素的超級細菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬單位到現(xiàn)在100多萬個單位，青霉素劑量似乎越來越大了。

對于做表達來說，如果不是要研究啟動子的強弱，通常比較少關心或者用到報告基因吧。綠色熒光蛋白是最chang用的報告基因了（注意選擇適用原核表達版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶啊，熒光素酶啊等等。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。

啟動子、終止子和核糖體結(jié)合位點

啟動子：啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達和誘導調(diào)控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最chang用的啟動子

組成型表達：表達載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達產(chǎn)物會影響細菌的生長，反過來影響表達量的積累。

誘導調(diào)控型表達：表達載體采用誘導型啟動子，只有在誘導劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導表達的，也屬于誘導表達系統(tǒng)。

融合表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（Tag），表達產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是*泛采用的Tag。

分泌表達：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，或者形成包含體，而且表達產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間。

可溶性表達：大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包含體容易純化但是復性效率不高。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作用——控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達導致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見的是rrnB  rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。

核糖體結(jié)合位點：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點開始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3'端互補的SD序列對形成翻譯起始復合物是必需的，多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達，要留意。

表達菌株：我們往往最容易忽視的一點。不同的表達載體對應有不同的表達菌株，一些特別設計的菌株更有助于解決一些表達難題，這一點生物通會有專門的介紹。同樣的，交換獲得的免費菌株，要小心其遺傳背景是否已經(jīng)發(fā)生改變？當心。

注：以上各種特性是可以相互組合的，不是排他的！