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            原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)心得!

            來源:上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司   2021年10月13日 10:34  

            人們合成與生物相關(guān)的物質(zhì)是從尿素開始的,1828年,德國(guó)化學(xué)家維勒人工合成了存在于生物體的這種有機(jī)物。在1960年我國(guó)科學(xué)家采用化學(xué)方法shou次成功地合成了具有生物活性的蛋白質(zhì)——胰島素。隨著內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程技術(shù)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)用各種不同的載體在原核、真核系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白表達(dá)更為行之有效。而這其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展得最為迅速、成熟。原核表達(dá)具有操作方便、快捷,需時(shí)較短,表達(dá)量大,適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。雖然也有缺少糖基化和表達(dá)后加工等問題,當(dāng)有了其它多種表達(dá)系統(tǒng)后,原核系統(tǒng)仍是我們合成外源蛋白的shou選。

                在網(wǎng)上看到有人把原核表達(dá)技術(shù)分成四個(gè)等級(jí):初次嘗試掃盲、亂棍打棗入門、系統(tǒng)優(yōu)化中級(jí)和自成一體高手,覺得十分有意思。但是根據(jù)筆者自己的經(jīng)驗(yàn)以及耳聞目睹的一些經(jīng)歷告訴我:做表達(dá)?那是謀事在人,成事在天。有時(shí)候你把克隆做出來了,雙酶切鑒定沒問題,測(cè)序沒問題,可是就是看不到表達(dá)帶。原因當(dāng)然可以分析,實(shí)驗(yàn)也是可以改進(jìn),但是竄改一下戈?duì)柼┑脑挘骸俺晒Φ膶?shí)驗(yàn)都是一樣的,失敗的實(shí)驗(yàn)各有各的不幸?!痹趯?shí)驗(yàn)遇到瓶頸的時(shí)候要如何進(jìn)行分析,找到問題的癥結(jié)是我們的實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵所在。在準(zhǔn)備進(jìn)行原核表達(dá)的時(shí)候需要考慮的因素很多,市面上可供選擇的載體、菌株也很多,要如何進(jìn)行正確的選擇,找到適合自己的載體是十分重要的。所以,現(xiàn)在要對(duì)目前常用的一些載體進(jìn)行介紹,讓我們對(duì)其相關(guān)產(chǎn)品及其表達(dá)原理進(jìn)行了解,以方便實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

                首先來一些大腸桿菌表達(dá)的基本概念:一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株,如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑,如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測(cè)等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩砜紤],比如表達(dá)量高低,目標(biāo)蛋白的活性,表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。主要?dú)w結(jié)在表達(dá)載體的選擇上。

            表達(dá)載體:我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動(dòng)子,多克隆位點(diǎn),終止密碼,融合Tag(如果有的話),復(fù)制子,篩選標(biāo)記/報(bào)告基因等。通常,載體很貴,我們可以通過實(shí)驗(yàn)室之間交換得到免費(fèi)的載體。但是要小心,輾轉(zhuǎn)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)實(shí)驗(yàn)室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景?MCS是否還是原來那個(gè)MCS?是我們要特別注意的。

            復(fù)制子:通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制,拷貝數(shù)低,pCoE1,pMBI(pUC)類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達(dá)500以上,是表達(dá)載體常用的。通常情況下質(zhì)??截悢?shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān),當(dāng)然也不是越多越好,超過細(xì)胞的承受范圍反而會(huì)損害細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果碰巧需要2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化,就要考慮復(fù)制元是否相容的問題。

            篩選標(biāo)記和報(bào)告基因:氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標(biāo)記,卡那霉素或者是新霉素次之,通常是另一個(gè)載體的篩選標(biāo)記用。四環(huán)素,紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微。抗性基因的選擇要注意是否會(huì)對(duì)研究對(duì)象產(chǎn)生干擾,比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達(dá)篩選中要注意的問題應(yīng)該就是LB倒板前加抗生素的溫度,溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。今天耐青霉素的超級(jí)細(xì)菌泛濫,不知道是否有我們實(shí)驗(yàn)人員的功勞呢?大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢?從以前的一針50萬(wàn)單位到現(xiàn)在100多萬(wàn)個(gè)單位,青霉素劑量似乎越來越大了。

            對(duì)于做表達(dá)來說,如果不是要研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱,通常比較少關(guān)心或者用到報(bào)告基因吧。綠色熒光蛋白是最chang用的報(bào)告基因了(注意選擇適用原核表達(dá)版本的GFP),其他還有半乳糖苷酶啊,熒光素酶啊等等。一些融合表達(dá)Tag也有報(bào)告基因的功能。

            啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)

            啟動(dòng)子:?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)弱是對(duì)表達(dá)量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和Tac,PL和PR,T7是最chang用的啟動(dòng)子

            組成型表達(dá):表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子,也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子,如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高,成本低,但是不適合表達(dá)一些對(duì)宿主細(xì)菌生長(zhǎng)有害的蛋白。因?yàn)檫^量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng),反過來影響表達(dá)量的積累。

            誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá):表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長(zhǎng)前期高表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響,又可減少菌體蛋白酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。另外也有啟動(dòng)子是組成型的,但是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的,也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

            融合表達(dá):表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽(Tag),表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白(有分N端或者C端融合表達(dá)),方便后繼的純化步驟或者檢測(cè)。對(duì)于特別小的分子建議用較大的Tag(如GST)以獲得穩(wěn)定表達(dá);而一般的基因多選擇小Tag以減少對(duì)目的蛋白的影響。His-Tag是*泛采用的Tag。

            分泌表達(dá):在起始密碼和目的基因之間加入信號(hào)肽,可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜,避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過度累積而影響細(xì)胞生長(zhǎng),或者形成包含體,而且表達(dá)產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間。

            可溶性表達(dá):大腸桿菌表達(dá)效率很高,特別是強(qiáng)啟動(dòng)子,目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒,包含體容易純化但是復(fù)性效率不高。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物,也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性,比如Thio,pMAL系統(tǒng)。

            轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)有重要作用——控制轉(zhuǎn)錄的RNA長(zhǎng)度提高穩(wěn)定性,避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動(dòng)子的通讀,降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類,Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和根據(jù)模版上的對(duì)稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見的是rrnB  rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。

            核糖體結(jié)合位點(diǎn):?jiǎn)?dòng)子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始延伸的一段堿基序列,其中能與rRNA16S亞基3'端互補(bǔ)的SD序列對(duì)形成翻譯起始復(fù)合物是必需的,多數(shù)載體啟動(dòng)子下游都有SD序列,也有些載體沒有,適合自帶SD序列的基因表達(dá),要留意。

            表達(dá)菌株:我們往往最容易忽視的一點(diǎn)。不同的表達(dá)載體對(duì)應(yīng)有不同的表達(dá)菌株,一些特別設(shè)計(jì)的菌株更有助于解決一些表達(dá)難題,這一點(diǎn)生物通會(huì)有專門的介紹。同樣的,交換獲得的免費(fèi)菌株,要小心其遺傳背景是否已經(jīng)發(fā)生改變?當(dāng)心。

            注:以上各種特性是可以相互組合的,不是排他的!

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