在細(xì)胞培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)這樣或那樣的問題,這些問題從細(xì)胞生長(zhǎng)角度來說,針對(duì)細(xì)胞不貼壁、生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)不好,甚至死亡的原因,我們做以下分析并提出相對(duì)應(yīng)的解決方法。
一、培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁
可能原因:
胰蛋白酶消化過度;
支原體污染;
培養(yǎng)基pH值過堿(NaHCO3分解);
細(xì)胞老化;
接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。
解決方法:
縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度;
分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物;
使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2;
啟用新的保種細(xì)胞;
調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。
二、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢
可能原因:
由于更換不同培養(yǎng)液或血清;
培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞;
培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染;
試劑保存不當(dāng);
接種細(xì)胞起始濃度太低;
細(xì)胞已老化;
支原體污染 。
解決方法:
比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分,比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液;
換入新鮮配置培養(yǎng)液,或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長(zhǎng)因子;
用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,丟棄培養(yǎng)物;
血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存,需在1周內(nèi)用完;
增加接種細(xì)胞起始濃度;
換用新的保種細(xì)胞;
分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。
三、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)不好
可能原因:
細(xì)胞本身的狀態(tài)
細(xì)胞傳代次數(shù)多,細(xì)胞老化;
細(xì)胞的接種量:接種量過低,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢;
細(xì)胞傳代時(shí)間過晚:細(xì)胞中毒,影響傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng);
胰酶消化時(shí)間過長(zhǎng)或過短:時(shí)間過長(zhǎng),細(xì)胞死亡;時(shí)間過短,細(xì)胞未*分離而成團(tuán),細(xì)胞死亡;
細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇:慢凍速融。
污染
支原體污染;
霉菌污染。
培養(yǎng)基或血清
更換血清或培養(yǎng)基之前未進(jìn)行驗(yàn)證;
選擇的培養(yǎng)基是否合適;
培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無誤。
培養(yǎng)環(huán)境
CO2供應(yīng)是否正常;
培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。
解決方法:
根據(jù)以上四個(gè)方面的可能原因,做出針對(duì)性的解決方案
注意細(xì)胞的本身狀態(tài):如傳代次數(shù)、接種量等;
避免產(chǎn)生污染(用正規(guī)、合法、可溯源的血清);
要用合適的血清或培養(yǎng)基,最好經(jīng)過驗(yàn)證;
注意實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境。
四、培養(yǎng)細(xì)胞死亡
可能原因:
培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2;
培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大;
細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷;
培養(yǎng)液滲透壓不正確;
培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積 。
解決方法:
檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2;
檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度;
取新的保存細(xì)胞種;
檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓;
換入新鮮培養(yǎng)液。
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