實(shí)驗(yàn)背景

細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生速率是一種描述細(xì)胞代謝的信息含量很高的測(cè)量，因?yàn)?/span>

ATP是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的主要能量貨幣。細(xì)胞的代謝調(diào)控使細(xì)胞根據(jù)ATP需求的變化調(diào)整ATP產(chǎn)生的變化來(lái)維持總的細(xì)胞內(nèi)的ATP水平。

  安捷倫Seahorse XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定被設(shè)計(jì)用來(lái)測(cè)量活細(xì)胞總的ATP產(chǎn)生速率。更重要的是，這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌騾^(qū)分哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)兩條主要的產(chǎn)生ATP的代謝途徑線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解ATP的產(chǎn)生。

常見問題

• 如果檢測(cè)液中含有不同的氧化底物（不同的P/O值），mitoATP產(chǎn)生速率如何計(jì)算？

    為了將ATP偶聯(lián)的呼吸轉(zhuǎn)換為線粒體的ATP產(chǎn)生速率，在電子傳遞鏈末端每還原一個(gè)氧原子，ADP磷酸化為ATP的化學(xué)計(jì)量學(xué)必須得到確定。不同的底物理論上最大的P/O值不同，并且依賴于化學(xué)計(jì)量學(xué)/底物氧化通路，以及F₁F₀ ATP合酶的效率。在標(biāo)準(zhǔn)的XF實(shí)驗(yàn)條件下，細(xì)胞被供給底物混合物（主要是葡萄糖，丙酮酸和谷氨酰胺），且通常內(nèi)源性底物儲(chǔ)備（糖原，脂肪酸，其他氨基酸）可用于線粒體氧化。因此，用幾種細(xì)胞系進(jìn)行了測(cè)試并確認(rèn)P/O值2.75準(zhǔn)確代表了外源性和內(nèi)外源性氧化底物混合物的平均P/O值。

當(dāng)進(jìn)行誘導(dǎo)的XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定時(shí)，誘導(dǎo)的速率是如何計(jì)算和報(bào)告的？

     在XF實(shí)時(shí)ATP速率誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中Summary Printout和Measure Sheet中的 Average Assay Parameter Calculations顯示的Induced Rate(s)是用急性注射和寡霉素注射之間所有測(cè)量的平均值計(jì)算的。然而，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)速率可以從Kinetic Rate Data（Measure Sheet）中獲得。

• XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定中定義的XF      ATP速率指數(shù)是什么？

    XF ATP速率指數(shù)是mitoATP產(chǎn)生速率與glycoATP產(chǎn)生速率的比值（即mitoATP rate/glycoATP rate）。這個(gè)比值是一個(gè)細(xì)胞代謝表型的定量指標(biāo)。代謝指數(shù)大于1代表大于50%的細(xì)胞ATP來(lái)自線粒體的ETC/氧化磷酸化，而指數(shù)小于1表示大于50%的總ATP是糖酵解途徑產(chǎn)生的。因?yàn)榇x指數(shù)是比值測(cè)量，所以它對(duì)于代謝表型的改變或轉(zhuǎn)換是高度敏感的。

• 為什么相同的細(xì)胞類型當(dāng)細(xì)胞以不同的密度種板時(shí)XF      ATP速率不一樣？

    細(xì)胞的代謝表型會(huì)被細(xì)胞對(duì)ATP的需求所影響。一般來(lái)說，處于增殖或分化中的細(xì)胞比融合（緩慢生長(zhǎng)）或末端分化的細(xì)胞擁有更高的糖酵解速率。為了比較實(shí)驗(yàn)之間的結(jié)果，推薦在整個(gè)研究過程中保持一致的細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞接種密度。

• 為什么必須用Seahorse      XF DMEM培養(yǎng)基，pH 7.4或Seahorse      XF RPMI培養(yǎng)基，pH 7.4來(lái)進(jìn)行這個(gè)實(shí)驗(yàn)？

       GlycoATP產(chǎn)生速率的計(jì)算需要對(duì)XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定中的糖酵解質(zhì)子流出速率進(jìn)行絕對(duì)測(cè)量。為了正確計(jì)算PER，檢測(cè)液必須要有一個(gè)固定的緩沖能力。培養(yǎng)基中低濃度的HEPES 在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間范圍內(nèi)提供了一致的緩沖能力值。雖然添加HEPES緩沖液輕微地減少了ECAR信號(hào)，但是它顯著提高了ECAR數(shù)據(jù)的質(zhì)量和一致性，以及轉(zhuǎn)換為PER的準(zhǔn)確性（更多詳情，請(qǐng)參閱White paper: Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology）。此外，使用預(yù)調(diào)pH到7.4的XF DMEM或XF RPMI培養(yǎng)基節(jié)省了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的時(shí)間，確保XF實(shí)驗(yàn)過程中一致的檢測(cè)液pH值。

• 我能夠使用其他的Seahorse      XF檢測(cè)液來(lái)運(yùn)行XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定嗎？

   GlycoATP產(chǎn)生速率的準(zhǔn)確計(jì)算需要使用一種沒有酚紅和碳酸氫鈉且低濃度HEPES緩沖液的檢測(cè)液。因此，強(qiáng)烈推薦使用安捷倫Seahorse XF DMEM（或RPMI），pH 7.4的培養(yǎng)基。任何偏離推薦的培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑（葡萄糖，丙酮酸鈉，谷氨酰胺），需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)（使用XF分析儀）確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)的緩沖系數(shù)（參閱Seahorse XF Buffer Factor Protocol以進(jìn)一步了解信息）。任何含有酚紅的檢測(cè)液不能在XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定中使用。

• 當(dāng)運(yùn)行誘導(dǎo)的XF實(shí)時(shí)ATP速率測(cè)定時(shí)，寡霉素注射之后的OCR高于基礎(chǔ)OCR，發(fā)生了什么？

     在寡霉素注射之前加入的化合物使電子傳遞與氧化磷酸化解偶聯(lián)（如FCCP，DNP等等），通常會(huì)導(dǎo)致OCR增加。然而，這種呼吸不與ATP的產(chǎn)生偶聯(lián)，因?yàn)闆]有ATP合酶的參與，線粒體膜電位會(huì)減少或消除，所以在這種環(huán)境下很少或沒有ATP生成。在這些情況下，基礎(chǔ)的mitoATP產(chǎn)生速率不能夠被準(zhǔn)確計(jì)算。如果懷疑存在解偶聯(lián)化合物，那么推薦添加一組對(duì)照組，注射檢測(cè)液+溶劑來(lái)計(jì)算基礎(chǔ)的mitoATP產(chǎn)生速率。