5’-核苷酸酶活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

產品貨號: BA1641

產品規(guī)格: 50T

產品簡介：

5'-核苷酸酶(5'-NT)是一種對底物特異性不高的水解酶，可作用于多種核苷酸。廣泛存在于各種植物、動物組織、 血清血漿中。5'-NT是一種特殊的磷酸酯水解酶，它只作用于核苷-5'-磷酸如AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成無機 磷酸和核苷。通過定磷顯色法測定所生成的無機磷含量，可以計算出5'-NT的活性高低。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。

產品組成：

溶液的配制： 

1. 試劑五：臨用前加入12 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑4℃保存兩周。

2. 試劑六：臨用前加入12 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑4℃保存兩周。

3. 工作液配制：臨用前取1支試劑一中加入到1瓶試劑二中充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存一周， 現(xiàn)用現(xiàn)配。

4. 定磷試劑的配制：按H2O：試劑五：試劑六：試劑七=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色。 若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。

5. 標準品：8mg磷標準品。臨用前加入4.6mL試劑四溶解配制成10μmol/mL的標準溶液，溶解后4℃保存兩周。

需自備的儀器和用品：

天平、可見分光光度計、臺式離心機、低溫離心機、恒溫水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、可調式移 液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟（僅供參考）：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻） 

1. 組織：按照質量（g）﹕提取液體積(mL)為1﹕5-10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液），冰上勻漿后于4℃，15000g離心10min，取上清置于冰上待測。

2. 細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）﹕蒸餾水體積（mL）為500-1000﹕1的比例（建議500萬個細胞加入1mL提取液）， 冰浴超聲波破碎細胞（功率300W，超聲3s，間隔7s，總時間3min）；然后4℃，15000g離心10 min，取上清置于冰上待測。

3. 血清：直接檢測。

二、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至660nm，蒸餾水調零。

2. 將標準品用試劑四稀釋至0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015μmol/mL標準液。

3. 操作表（在1.5 mL EP管中操作）

（1）酶促反應

（2）顯色反應

三、5'-NT活性計算

標準曲線的繪制： 以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（μmol/mL）。

5'-NT 活性的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每 mg 組織蛋白在反應體系中每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

5'-NT酶活（U/mg prot）=x×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×103=333.3×x÷Cpr

（2）按樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織在反應體系中每分鐘產生1 nmol無機磷定義為一個酶活單位。

5'-NT酶活（U/g質量）=x×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×103=333.3×x÷W

（3）按細胞數(shù)計算：

酶活單位定義：每10⁴個細胞在反應體系中每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

5'-NT酶活（U/10⁴ cell）=x×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T×103=333.3×x÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算：

酶活單位定義：每毫升液體在反應體系中每分鐘產生1 nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

5'-NT酶活（U/mL）=x×V反總÷V樣÷T×103=333.3×x

V樣：酶促反應中加入樣本體積，0.1mL；V反總：酶促反應總體積，1mL；V樣總：加入提取液的體積，1mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細胞數(shù)量：以萬計；T：酶促反應時間，30 min；10³：單位換算，1μmol=10³nmol。

注意事項:

1. ΔA測定大于1或者A測定管大于1時，建議將樣本用試劑四稀釋后再進行測定。

實驗實例： 

1. 取0.1g小鼠肝，進行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.723- 0.534=0.189，帶入標準曲線y=2.3928x+0.0165，計算x=0.0721，按照樣本質量計算酶活得：

5'-NT酶活（U/g質量）=333.3×x÷W=333.3×0.0721÷0.1=240.31 U/g 質量。

2. 取0.1g稗草，進行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.367-0.281=0.086， 帶入標準曲線y=2.3928x+0.0165，計算x=0.0290，按照樣本質量計算酶活得：

5'-NT酶活（U/g質量）=333.3×x÷W=333.3×0.0290÷0.1=96.657 U/g質量。