9號(hào)培養(yǎng)基的檢測(cè)方法與應(yīng)用！

一、背景

9號(hào)培養(yǎng)基用于多粘菌素等抗生素效價(jià)測(cè)定的底層培養(yǎng)基，成分(g/L)：胰酶消化酪蛋白胨17.0；大豆粉木瓜酶消化物3.0；氯化鈉5.0；磷酸氫二鉀2.5；葡萄糖2.5；Agar/瓊脂20.0；pH值7.2±0.1 25℃。

用法：稱(chēng)取本品50.0g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。

多粘菌素系由多粘芽胞桿菌（bacilluspolymyxa）產(chǎn)生的一組多肽類(lèi)抗生素。多粘菌素和供藥用。常用其硫酸鹽，為白色結(jié)晶性粉末，易溶于水，有引濕性。在酸性溶液中穩(wěn)定，其中性溶液在室溫放置一周不影響效價(jià)，堿性溶液不穩(wěn)定。

多粘菌素抗菌譜及臨床應(yīng)用與多粘菌素相似，對(duì)革蘭陰性桿菌，如大腸桿菌、綠膿桿菌、副大腸桿菌、肺炎克雷白桿菌、嗜酸桿菌、百日咳桿菌及痢疾桿菌等有抑制或殺菌作用。臨床上主要用于敏感菌引起的感染及綠膿桿菌引起的泌尿系統(tǒng)感染、以及眼、氣管、腦膜炎、敗血癥、燒傷感染以及皮膚粘膜感染等。

多粘菌素對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷白桿菌，以及嗜血桿菌、腸桿菌屬、沙門(mén)菌、志賀菌、百日咳桿菌、巴斯德菌和弧菌等革蘭陰性菌有抗菌作用。變形桿菌、奈瑟菌、沙雷菌、普魯威登菌、革蘭陽(yáng)性菌和專(zhuān)性厭氧菌均對(duì)本類(lèi)藥物不敏感。細(xì)菌對(duì)本品與多粘菌素之間有交叉耐藥性，但對(duì)本類(lèi)藥物與他類(lèi)抗菌藥物間則沒(méi)有交叉耐藥性發(fā)現(xiàn)。

二、應(yīng)用

用于多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素的耐藥機(jī)制研究：

測(cè)臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌中攜帶的β-內(nèi)酰胺酶基因及外排泵基因,體外誘導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素產(chǎn)生耐藥,以探討其對(duì)多粘菌素的耐藥機(jī)制。

三、方法

1、連續(xù)收集臨床分離的63株非重復(fù)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌,采用微量肉湯稀釋法測(cè)定亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、多粘菌素及頭孢哌酮舒巴坦的抑菌濃度（MICs）。

2、采用腸桿菌科基因間重復(fù)序列-聚合酶鏈反應(yīng)（ERIC-PCR）獲得63株鮑曼不動(dòng)桿菌的指紋圖譜并進(jìn)行同源性分析。

3、采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因TEM、AmpC、OXA-23、KPC、IMP、VIM,外排泵基因adeB、adeG、adeJ、adeR、adeS,兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因pmrA、pmr B。

4、采用體外實(shí)驗(yàn)對(duì)收集的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥,以獲得多粘菌素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌。

5、采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)誘導(dǎo)耐藥菌株及原始敏感菌株的外排泵基因adeB、adeJ、adeG及兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因pmrA、pmr B的m RNA表達(dá)情況,分析其表達(dá)差異。

6、對(duì)負(fù)責(zé)脂質(zhì)A生物合成的基因lpxA/lpxC/lpxD及兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因pmr A、pmrB進(jìn)行PCR擴(kuò)增并將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,探討耐藥菌株是否發(fā)生特異性突變。

7、采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）對(duì)誘導(dǎo)耐藥的菌株及原始敏感菌株進(jìn)行檢測(cè),分析其蛋白質(zhì)差異。

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