5×考馬斯亮藍(lán)G-250（蛋白定量用）

產(chǎn)品貨號：R21944

產(chǎn)品規(guī)格：100ml/500ml

產(chǎn)品簡介：

考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由465nm變?yōu)?/span>595nm，在一定的濃度范圍內(nèi)，測定的吸光度值A595與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，樣品中巰基乙醇的濃度可高達(dá)1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá)5mM，但受略高濃度的去垢劑影響，需確保SDS的濃度低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20, 60, 80低于0.06%。含去垢劑的樣品推薦使用尚寶生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒。

產(chǎn)品組成：

自備試劑：

PBS、BSA標(biāo)準(zhǔn)品(5mg/ml)

操作步驟：

1. 微孔酶標(biāo)儀法

2. *溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10ul，稀釋至250ul ，使終濃度為0.2mg/ml。待測蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

3. 5×G250染色液使用前請顛倒3-5次混勻，取1ml 5×G250染色液，加入4ml雙蒸水，混勻成1×G250染色液，此 1×G250染色液可在4℃保存一周。

4. 將標(biāo)準(zhǔn)品按0,2,4,6,8,12,16,20微升分別加到96孔板中，加PBS稀釋液補(bǔ)足到20微升。

5. 將樣品作適當(dāng)稀釋（最好多做幾個梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋），加20微升到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量時的誤差，標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣 品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2后。

6. 各孔加入200微升稀釋后的1×G250染色液，室溫放置3-5分鐘。

7. 用酶標(biāo)儀測定A595，或560-610nm之間的其它波長的吸光度。

8. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

9. 分光光度計(jì)法 

   如無酶標(biāo)儀，染色反應(yīng)可在離心管中進(jìn)行，反應(yīng)液混勻后加入比色皿中，使用分光光度計(jì)測定吸光值。

   步驟如下：

10. 取八支（或者更多）干凈的10ml離心管，標(biāo)記上號。

11. 取100ulBSA加入PBS 2.4ml稀釋至終濃度為0.2mg/ml。

12. 5×G250 染色液使用前請顛倒3-5次混勻，取10ml 5×G250染色液，加入40ml雙蒸水，混勻成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。

13. 按下表加入試劑(以每孔5ml 計(jì)，多余的用來清洗比色皿)

     

     

     

1. 反應(yīng)3分鐘后測OD值。為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，可每間隔2分鐘加一管染色液，每間隔2分鐘測一管OD值。如下表：