人類Vav2蛋白的DH結(jié)構(gòu)域已在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。它含有一個(gè)6xHis標(biāo)記在其氨基末端用于純化。注冊(cè)號(hào)為NM001134398.1。GE06的分子量約為25kDa。Vav2 DH蛋白以白色凍干粉末的形式提供。蛋白質(zhì)純度通過(guò)在4-20%聚丙烯酰胺梯度凝膠上掃描考馬斯藍(lán)染色蛋白質(zhì)的密度測(cè)定來(lái)確定。Vav2 DH蛋白的純度約為80%。

Cytoskeleton/艾美捷Vav2蛋白是一種對(duì)Rac1有選擇性的鳥(niǎo)嘌呤交換因子，在多種條件下介導(dǎo)Rac1激活，并與胃腫瘤以及細(xì)胞體積控制和神經(jīng)軸突延伸有關(guān)：

1.Vav2 GTP/GDP交換活性抑制劑的研究

2.Vav2 DH結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白的鑒定

3.不同GTP酶對(duì)Vav2-GEF活性的研究

Cytoskeleton 覆蓋肌動(dòng)蛋白，微管蛋白，馬達(dá)蛋白，小G蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)，活細(xì)胞成像等相關(guān)領(lǐng)域，提供對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，抗體，檢測(cè)與分析試劑盒。

Cytoskeleton/艾美捷Vav2蛋白生物活性測(cè)定：

Vav2 DH的生物活性可以通過(guò)其催化Rac1上核苷酸交換的能力來(lái)確定，使用Bodipy GDP的核苷酸交換試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)量的GDP或GTP。Rac1蛋白質(zhì)通過(guò)添加過(guò)量的EDTA預(yù)加載Bodipy FL GDP，例如，反應(yīng)中每mmol Mg2+離子添加0.7 mmol EDTA。然后以解離分析的形式使用該子儲(chǔ)備溶液，這表明與未標(biāo)記的核苷酸競(jìng)爭(zhēng)交換位點(diǎn)。反應(yīng)通過(guò)485nm Ex/535nm Em下的熒光測(cè)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。嚴(yán)格的質(zhì)量控制確保在存在0.8µM Vav2 DH的情況下，Bodipy GTP或mant GTP的交換率至少提高五倍。

方法：

1.將Vav2小瓶放在冰上，用冰冷交換緩沖液稀釋至0.30微克/微升（8微升）。

2.用冰冷交換緩沖液將Rac蛋白稀釋至1.25µg/µl（50µM）。

3.在新鮮的15毫升Falcon管中加入以下成分，并通過(guò)移液管或輕輕旋渦充分混合：

每口井的成分微升交換緩沖區(qū)75

50µM?Rac 5

8µM Vav2 10

注：對(duì)于總混合物體積，將每個(gè)孔的試劑體積乘以實(shí)驗(yàn)中的孔數(shù)，再加上20%的體積以計(jì)算移液損失。

4.在室溫（RT）下培養(yǎng)20分鐘。

5.通過(guò)添加10µl（每孔）50 mM MgCl2鎖定核苷酸。

6.設(shè)置熒光計(jì)，激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm+/-15 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm+/-15 nm。

7.將預(yù)加載的混合物等分到指丨定的孔中，并將平板放入熒光計(jì)中。

8.在5個(gè)周期（150秒）后，將程序置于保持或暫停狀態(tài)，然后卸下平板。

9.移取10µl a）5 mM GTP溶液，b）小化合物，c）測(cè)試蛋白質(zhì)，d）4 mM EDTA（+ve交換對(duì)照）或e）稀釋緩沖液（陰性對(duì)照）于各孔中，并立即上下移液兩次，然后繼續(xù)讀取20分鐘。

10.完成動(dòng)力學(xué)方案后保存讀數(shù)。通過(guò)將數(shù)據(jù)減少到最大斜率（使用12個(gè)點(diǎn)）或Vmax，并使用讀板器附帶的軟件，可以計(jì)算匯率。交換曲線可以通過(guò)導(dǎo)出到Microsoft Excel來(lái)實(shí)現(xiàn)。

艾美捷科技是Cytoskeleton的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。