主要用途

細(xì)胞總脂肪酶（lipase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物三丁酸二巰基丙醇受到脂肪酶水解，釋放出巰基基團(tuán)，使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲等）脂肪酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂質(zhì)分子的酯鍵（ester bond）的水解。在人體中，其來源于胰腺產(chǎn)生。在消化系統(tǒng)中，脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG），產(chǎn)生1個(gè)分子甘油（glycerol）和3個(gè)分子游離脂肪酸分子（fatty acid）。脂肪酶異常增高與胰腺炎、胰腺管阻塞、胰腺癌、腎病、唾液腺炎癥、腸道阻塞等相關(guān)；異常降低則與胰腺中脂肪酶產(chǎn)生細(xì)胞的性損傷有關(guān)。脂肪酶的活性檢測是臨床診斷的指標(biāo)之一。基于脂肪酶在水分子的參與下，催化三丁酸二巰基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，產(chǎn)生二巰基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并釋放出巰基基團(tuán)（－SH），進(jìn)而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）           毫升

裂解液（Reagent B）            毫升

緩沖液（Reagent C）           毫升

反應(yīng)液（Reagent D）           毫升

底色液（Reagent E）            毫升

補(bǔ)充液（Reagent F）            毫升

產(chǎn)品說明書              1份

保存方式

保存反應(yīng)液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離鐵壁細(xì)胞

DOUNCE勻漿器：用于組織裂解

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿或96孔板：用于反應(yīng)和比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群

11． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

12． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約80下）

13． 將所有細(xì)胞勻漿物移入1.5毫升離心管

14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

15． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長412nm，間隔10分鐘，讀數(shù)4次（共30分鐘），并置零 

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對(duì)照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升底色液（Reagent E）

3． 上下傾倒數(shù)次，混勻

4． 在37℃溫度下孵育3分鐘

5． 加入50微升待測樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對(duì)照（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、 樣品測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底色液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入50微升待測樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

五、 計(jì)算樣品活性

六、酶標(biāo)儀測定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）到樣品孔里

4． 加入xx微升陰性液（Reagent F）到背景對(duì)照孔里

5． 分別加入xx微升底色液（Reagent E）到所有孔里

6． 輕輕搖動(dòng)96孔板

7． 在37℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入10微升待測樣品（或20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）

9． 輕輕搖動(dòng)96孔板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測，包括（0分鐘初始讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)）

11． 活性計(jì)算

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為50次（96孔板，包括50次樣品和50次背景對(duì)照）和12次（比色皿，包括12次樣品和12次背景對(duì)照）操作

2． 本產(chǎn)品檢測范圍是40至1600毫單位/毫升

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 每次樣品測定，需要背景測定一次

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 樣品中避免含有EDTA、TWEEN20、NP40、巰基乙醇、DTT等，否則干擾檢測

7． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測定

8． 比色測定后，比色皿須清洗*

9． 建議待測樣本的蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）

10． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

11． 脂肪酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾三丁酸二巰基丙醇

12． 本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化檢測試劑產(chǎn)品