摘要:合成或人工色素在食品和飲料中作為添加劑，可以改善產(chǎn)品的外觀。在本研究中，我們開發(fā)了一種穩(wěn)定的反相高效液相色譜 (RP-HPLC) 方法，實現(xiàn)了 10 種合成色素的同時測定。采用配有 Agilent Poroshell EC-C18 色譜柱的 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統(tǒng)實現(xiàn)分離和定量分析。通過部分驗證確定了方法的穩(wěn)定性。通過分析糖果中的色素添加劑，證明了該方法定量分析食品基質(zhì)中人工色素的適用性。最后，將 HPLC 方法有效轉(zhuǎn)換為一個耗時短的超高壓液相色譜 (UHPLC) 方法，采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)，實現(xiàn)更快速的分析，且不損失分離度。采用 Agilent 1290 Infinity 二極管陣列檢測器 (DAD)，可以選擇不同的波長，實現(xiàn)在不同色素各自的最大吸收波長處進(jìn)行定量測定。采用兩種方法，分別確定了每種色素的檢測限 (LOD)、定量限 (LOQ)、精密度、準(zhǔn)確度和線性。在分析工作流程中采用 Agilent 7696A 樣品制備工作臺，幫助在LOD、LOQ 和線性研究中進(jìn)行樣品前處理。

前言色素添加劑是指加入食品中使其帶顏色的任何染料、色素或物質(zhì)1。當(dāng)前有主要來源于植物或動物的天然和合成色素添加劑。如：姜黃和藏紅花。合成色素是化學(xué)合成的色素，如酒石黃和靛胭脂2。在食品中加入色素有許多原因。其中包括補償因長期儲存出現(xiàn)的褪色、糾正顏色的自然變化，以及使無色食品著色等。實際上，色素添加劑是市場上大多數(shù)包裝食品不可避免的一類成分1。研究業(yè)已證明，人工色素暴露量超出每日攝入*將會導(dǎo)致兒童產(chǎn)生多動癥和其他不安行為3。美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 已經(jīng)制定了相關(guān)條例，旨在控制和確保食品中僅含有允許使用的色素添加劑。這就強調(diào)了使用精確的分析技術(shù)對色素進(jìn)行鑒別和定量分析的重要性。在本文中，我們采用 Agilent Poroshell120 EC-C18 色譜柱，開發(fā)了一個反相高壓液相色譜方法。食品色素的水溶性使反相 HPLC 成為分析這些物質(zhì)的理想技術(shù)。

方法儀器與軟件Agilent 1260 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)包括如下模塊：• Agilent 1260 Infinity 四元泵和真空脫氣機 (G1311B)• Agilent 1260 Infinity 高效自動進(jìn)樣器(G1367E)• Agilent 1260 Infinity 柱溫箱 (G1316A)• 帶最大光強流通池（60 mm 光程）(G4212-60007) 的 Agilent 1260Infinity 二極管陣列檢測器 (G4212B)• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，4.6 x 150 mm，2.7 µm (693975 902)開發(fā)和運行 UHPLC 分析所使用的 Agilent1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)包括：• 集成了真空脫氣機 (G4220A) 和 100 µLJet Weaver 混合器的 Agilent 1290Infinity 二元泵• Agilent 1290 Infinity 高效自動進(jìn)樣器(G4226A)• Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)• 帶最大光強流通池（1.0 µL 擴(kuò)散體積，10 mm 光程）(G4212-60008) 的 Agilent1290 Infinity 二極管陣列檢測器 (G4212A)• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，內(nèi)徑 2.1 mm，柱長 75 mm，采用 2.7 µm顆粒填充 (697775-902)兩套系統(tǒng)均采用安捷倫化學(xué)工作站（B.04.02 版）進(jìn)行控制。系列線性濃度稀釋樣品采用 Agilent 7696A樣品制備工作臺制備。

試劑與材料所有化學(xué)品和溶劑均為 HPLC 級，高純水使用 Milli Q 水純化系統(tǒng)（Millipore Elix10 型，美國）制備。甲醇為超梯度級，購自 Lab-Scan 公司（泰國曼谷）。磷酸氫二鈉和正磷酸購自 Fluka 公司（德國）。二甲基亞砜 (DMSO) 購自 Qualigens 公司（印度）。酒石黃、莧菜紅、靛胭脂、胭脂紅 4R、日落黃 FCF、紅色酸性染料、固綠 FCF、酸性藍(lán)/亮藍(lán)、胭脂紅 3R，以及赤蘚紅 B 標(biāo)準(zhǔn)品購自 Aldrich 公司（印度）。用于回收率和定量分析的糖果購自本地。

色譜參數(shù)反相液相色譜和 UHPLC 中使用的色譜參數(shù)見表 1。

色素標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取各標(biāo)準(zhǔn)品約 20 mg，分置于 10 mL 容量瓶中，分別制備酒石黃、莧菜紅、靛胭脂、胭脂紅 4R、日落黃 FCF、紅色酸性染料、固綠 FCF、酸性藍(lán)/亮藍(lán)、胭脂紅 3R，以及赤蘚紅 B 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。于每個容量瓶中加入 300 µL DMSO，將流動相 A 和 B 按照 80:20 的比例預(yù)混合的溶液作為稀釋劑。需要時超聲處理?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液和線性濃度精確量取各標(biāo)準(zhǔn)溶液約 100 µL 并混合，加入稀釋劑至 2000 µL，得到每種色素濃度均為 200 ppm 的色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。使用 Agilent 7696A 樣品制備工作臺連續(xù)稀釋該 200 ppm 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，制備系列線性濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。線性標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍為 0.01 ng/µL – 200 ng/µL（10 個濃度水平及各重復(fù) 6 次）。

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用于色素定量分析和回收率研究的樣品前處理使用不同類型的樣品（即包含不同色素的糖果）進(jìn)行色素定量分析和回收率研究。依次向 2 g 糖果中加入 400 µL DMSO 和20 mL 稀釋劑，提取其中的色素，過程非常簡單。超聲處理并采用帶有 C0650轉(zhuǎn)子的 Beckman Coulter Allegra X22R 離心系統(tǒng)，以 8300 rcf 的離心力離心 10 min后，溶液通過 0.25 µm PTFE AgilentEconofilter 注射式過濾器濾膜過濾，濾液待分析。使用加標(biāo)和不加標(biāo)的糖果樣品進(jìn)行回收率研究。樣品加標(biāo)采用柱上濃度為 25 ng 的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。提取過程如前所述。

預(yù)防措施為了延長化合物在溶液中的穩(wěn)定性，不使用時，所有制備的溶液用鋁箔包裹，并于冰箱暗處 4 °C 貯存。分析期間，可恒溫的自動進(jìn)樣器樣品盤保持在 5 °C。步驟表 2 所示的系列濃度校準(zhǔn)溶液是采用稀釋劑系列稀釋 200 ng/µL 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液而得。在兩個系列溶液的配制中，采用帶500 µL 注射器的 Agilent 7696A 樣品制備工作臺來配制線性濃度的溶液。在第一序列，向每個樣品瓶中加入一定量的稀釋劑；在第二序列，將 250 µL 200 ng/µL的溶液加入樣品瓶并渦旋 15 s。注意,除了分別運行這兩個序列外，這些步驟也可以在一個方法中編程并在一個序列中運行。取上一個濃度的溶液 250/100 µL置于下一個濃度的樣品瓶中進(jìn)行系列稀釋。Agilent 7696A 樣品制備工作臺設(shè)置的注射器參數(shù)見表 3。Agilent 7696A 樣品制備工作臺4 的設(shè)置在安捷倫應(yīng)用簡報（出版號 5990 6850CHCN）中有詳細(xì)描述。進(jìn)樣分析 5 µL 含有 DMSO 的稀釋液作為空白，然后依次進(jìn)樣分析系列濃度的各校準(zhǔn)溶液，每個濃度平行分析 6 次。用每個濃度的峰面積和保留時間 (RT) 數(shù)據(jù)來計算標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD) 和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)值。并以較低線性濃度溶液的進(jìn)樣分析確定 LOD 和 LOQ。以各色素每個線性濃度峰面積的平均值對其相應(yīng)濃度作圖，構(gòu)建線性曲線。

通過改變 6 個關(guān)鍵的方法參數(shù)來評估方法的穩(wěn)定性。平行 6 次進(jìn)樣分析含每種色素各約 30 ng（柱上量）的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，利用獲得的數(shù)據(jù)來研究方法的穩(wěn)定性。分別進(jìn)樣分析 2 g 糖果中加標(biāo) 25 ng 色素添加劑標(biāo)準(zhǔn)品和不加標(biāo)的樣品溶液，來研究方法的回收率。利用所有 10 種色素標(biāo)準(zhǔn)品的特征圖譜建立其 UV 譜庫。連同保留時間，該譜庫可用來鑒定糖果中的色素添加劑。該方法可有效轉(zhuǎn)換到 UHPLC。評價了每種色素的 LOD、LOQ 和線性，方法精密度通過峰面積和 RT 的 RSD 來確定。同時還繪制了所有色素使用 UHPLC 方法的線性曲線。UHPLC 方法可使分析更快速，并且不損失分離度

結(jié)果與討論分離與檢測采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm x 4.6 mm，2.7 µm）色譜柱，這 10 種色素在 20 min 內(nèi)實現(xiàn)了良好分離。不同的色素具有不同的最大吸收波長。這 10 種色素的色譜流出曲線見圖 1，色素列表及其各自的最大吸收波長見表 4。我們使用化學(xué)工作站軟件中的峰純度功能檢查各色譜峰的純度，從而評價了方法的專屬性。通過對精密度、線性范圍、準(zhǔn)確度、專屬性、回收率和穩(wěn)定性進(jìn)行研究來驗證本方法。

檢測限 (LOD) 與定量限 (LOQ)信噪比 (S/N) > 3 時的分析物濃度定義為LOD，S/N > 10 時的分析物濃度定義為LOQ。測得的每種色素的 LOD 和 LOQ 值見表 5。作為一個實例，圖 2 展示了胭脂紅 4R LOQ 濃度（柱上量 0.1 ng）時與空白的疊加色譜圖。

線性所有制備的線性濃度溶液平行進(jìn)樣分析6 次，利用峰面積響應(yīng)及其相應(yīng)的濃度值來構(gòu)建每種色素從 LOQ 濃度到最高濃度的線性曲線。獲得的所有色素的相關(guān)系數(shù)