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步驟一，根據(jù)實驗目的，選擇目標Marker。
通過閱讀相關文獻，了解您實驗需要選擇哪些Marker，以及這些Marker之間的邏輯關系（圈門的父子關系，比如T細胞CD3是“父”，而CD4或者CD8就是“子”）。
這里列舉了一些常見的細胞標志Marker：
B Cells | CD19 |
T Cells | CD3, CD4, CD8 |
Treg Cells | CD4, CD25, CD127 |
Th1/Th2/Th17 Cells | CD4, IFN-γ, IL-4, IL-17 |
Dendritic Cells | CD1c, CD83, CD141, CD209, MHC II |
Natural Killer Cells | CD3-, CD16, CD56 |
Macrophage | CD11b, CD68, CD163 |
Monocyte | CD14, CD16, CD64 |
Plasma Cells | CD138 |
Red Blood Cells | CD235a |
B Cells | CD19 |
T Cells | CD3, CD4, CD8 |
Treg Cells | CD4, CD25, Foxp3 |
Th1/Th2/Th17 Cells | CD4, IFN-γ, IL-4, IL-17 |
Dendritic Cells | CD11c, MHC II |
Natural Killer Cells | CD3-, CD49b (clone DX5) or NK1.1 |
Macrophage | F4/80, CD11b, CD80, CD86, CD206 |
Monocyte | CD11b, CD115, Gr-1, Ly-6C |
Plasma Cells | CD138 |
Red Blood Cells | TER-119 |
步驟二，確認Marker的表達位置。
對于細胞質(zhì)或者細胞核的Marker，需要對細胞進行固定破膜/破核膜。在做胞質(zhì)或胞核Marker染色實驗操作時，需要先染細胞表面Marker，再對細胞進行固定破膜，最后對胞內(nèi)或核內(nèi)Marker染色。此時細胞表面的Marker盡量避免使用串聯(lián)染料，因為“固定”容易對串聯(lián)熒光素造成影響。
一般來說，絕大部分CD分子指標，都是細胞表面指標；IL白介系列、IFN-γ、TNF-α等，屬于胞內(nèi)指標；而常見的核內(nèi)染色指標是Foxp3。
確認Marker表達位置的同時，我們還需要了解Marker的表達量。前面提到過“強弱搭配”，我們需要通過表達量的強弱，來搭配熒光素的弱強。
通常，根據(jù)待測細胞類型中，相應抗原的表達量，可以粗略地將抗原分子分為三類：
01
很容易鑒定、容易區(qū)分陰陽性細胞群、陰陽性峰明顯分開的抗原。例如: CD3，CD4，CD19等。
02
很容易鑒定、較高水平表達、經(jīng)常連續(xù)性表達。例如: CD27，CD28，CD45RA, CD45RO等。
03
低水平表達、激活性Marker、未知但關鍵。例如: CD25，STAT5，F(xiàn)oxp3等。
表達量的強弱，可以參考廠家的質(zhì)檢結(jié)果，但更多地需要參考文獻里具體細胞群體的表達。
步驟三，了解實驗所用流式細胞儀的配置信息，包括：流式細胞儀的激光器、檢測通道和濾光片等。
上期提到：流式細胞儀是同時檢測多種熒光的，這些熒光之間可能存在干擾。我們需要根據(jù)流式細胞儀的通道，來確認有哪些熒光素可以選擇，這樣可以在后期搭配的時候，盡量避免干擾。如果沒有儀器的通道信息，是無法去確定哪些熒光素可供選擇的?？梢哉f，如果沒有儀器通道信息，配色就是“無源之水，無本之木”。
通過儀器通道信息，確認可以選擇哪些熒光素后，我們還需要了解熒光素的信息，確認這些熒光素的激發(fā)波長和發(fā)射波長、接收該熒光的濾光片等信息，是否和流式細胞儀的通道一致。
▲ 常見熒光基團信息
步驟四，了解熒光素的強度。
下表列出了常見熒光素的強度：
在已確定Marker的強弱，和流式細胞儀可檢測的熒光素的強弱后，我們要遵循“強弱搭配原則”，進行配色。
強表達抗原，可以選擇弱熒光素，也可以選擇強熒光素。
如下圖所示，強表達抗原CD3，選擇弱熒光素FITC或強熒光素APC，對實驗結(jié)果影響不大。
弱表達抗原，一定要選擇強熒光素。
如下圖所示，弱表達的抗原CD25，選擇弱熒光素PerCP，會導致陰陽性細胞群分不開。如果選擇強熒光素PE，可以看到明顯的陽性細胞群。
當然，有些老師在配色時，也會遇到一些其他的問題，如：細胞樣本有自發(fā)熒光、細胞處理容易出現(xiàn)死細胞（需要額外增加死活細胞染料）等。因此，我們需要特別注意，將對應通道的熒光檢測信息，預留給自發(fā)熒光，或者死活染料檢測。
相信在了解了流式配色的基本原則及操作步驟后，大家的實驗也能更加順利地開展啦~
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