磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟

分光光度法50管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

植物葉綠體中磷酸丙糖異構(gòu)酶是光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉(zhuǎn)化，磷酸二羥丙酮能快速透過(guò)葉綠體的包膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并在其中逐步轉(zhuǎn)化為蔗糖。

測(cè)定原理：

磷酸丙糖異構(gòu)酶將磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛與NAD在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性的高低。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、研缽、震蕩儀、紫外分光光度計(jì)、1 mL石英比色皿。

試劑組成和配制：

提取液一：液體50mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加5mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟酶液提取：

①總TPI酶提?。?/span>建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體TPI酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測(cè)定胞漿TPI酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定葉綠體中TPI酶活性。

建議測(cè)定總TPI酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的TPI，則按照步驟②提取粗酶液。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 取1mL石英比色皿，依次加入600μL試劑一，100μL試劑二，100μL試劑三，100μL試劑四，100μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A2-A1

計(jì)算公式：

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min /mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min /g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟