急性梗塞發(fā)生后，作為實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確和有效治療的第一步，臨床醫(yī)生需要快速且精確定位心肌缺血組織?，F(xiàn)今早期心臟病發(fā)作的診斷基于生化血液分析（檢測(cè)心肌酶）或超聲波輔助成像，耗時(shí)且空間分辨率低?？朔@些經(jīng)典技術(shù)局限性的新技術(shù)也就應(yīng)運(yùn)而生，如納米技術(shù)。由此西班牙和中國研究人員S. Mateos等利用生物功能化的近紅外發(fā)光納米粒子，對(duì)急性心肌梗塞后的心臟進(jìn)行了體內(nèi)成像。利用近紅外熒光成像的*采集速度和納米粒子的高效選擇靶向性，在急性梗塞事件后僅幾分鐘就可獲得梗塞心臟的體內(nèi)圖像。為急性梗塞后缺血心肌的高效、快速和準(zhǔn)確的體內(nèi)成像開辟了一條途徑。研究成果以“Instantaneous In Vivo Imaging of Acute Myocardial Infarct by NIR-IILuminescent Nanodots”為題發(fā)表于Small。

  背景

 心血管疾病（CVD）嚴(yán)重威脅人類健康，且影響越來越大，使得提高CVD診斷能力變得尤為關(guān)鍵。在心血管事件（如梗塞）早期，如果診斷及時(shí)，會(huì)大大提高康復(fù)治療的效果。此外早期診為減輕事件對(duì)患者的影響提供了更多時(shí)間，減輕了醫(yī)療系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)。特別是急性心肌梗塞（心臟病發(fā)作）中，冠狀動(dòng)脈閉塞事件引發(fā)心肌缺血和缺氧，通常導(dǎo)致不可修復(fù)的損傷和/或死亡，因此早期診斷、評(píng)估和治療顯得尤為重要。目前臨床對(duì)心肌梗塞的成像和診斷的依賴超聲成像（分辨率低）、生化血液分析（相對(duì)較慢）、磁共振成像（昂貴耗時(shí)）以及核醫(yī)學(xué)如x光血管造影、斷層攝影技術(shù)（昂貴且有害）。因此仍亟需開發(fā)新的成像技術(shù)，能夠在急性梗塞后對(duì)心臟進(jìn)行低成本、快速和無電離輻射的可視化及診斷。

 隨著材料合成和修飾的進(jìn)步，促成了基于使用納米粒子作造影劑的新診斷技術(shù)和療法。如基于磁性納米粒子、脂質(zhì)體和多孔硅（PSi）納米粒子的梗塞心臟成像。但它們或者無法進(jìn)行體內(nèi)成像，或者需要昂貴的儀器。發(fā)光納米粒子（LNP）可以克服這些限制（表1）。但800nm以下熒光成像的固有局限性（如穿透深度差、與自發(fā)熒光的不良重疊）限制了這些納米粒子的臨床應(yīng)用。此外使用LNP只能在梗塞后幾小時(shí)/幾天對(duì)梗塞心臟進(jìn)行體內(nèi)成像，仍無法實(shí)現(xiàn)快速（幾分鐘）體內(nèi)診斷。

 近紅外二區(qū)（NIR-II）發(fā)光的LNP可解決800nm以下熒光成像的局限性問題。在NIR-II光譜覆蓋的1000nm-1700nm內(nèi)，組織會(huì)隨著消光系數(shù)最小化而變得部分透明。此外NIR-II熒光成像可減少背景自發(fā)熒光和組織引發(fā)的散射。通過使用稀土摻雜的納米粒子、碳基納米粒子、半導(dǎo)體有機(jī)聚合物和納米粒子或半導(dǎo)體量子點(diǎn)（QDs），NIR-II體內(nèi)熒光成像能力得到了驗(yàn)證。其中Ag₂S納米點(diǎn)（nanodots, NDs）由于合成方便、亮度好、毒性小、生物相容性好而廣受關(guān)注，并已成功用于體內(nèi)癌癥、血管成像、生物分布研究、光熱治療、非接觸式熱感應(yīng)、放射診斷和心血管系統(tǒng)成像。其中一些應(yīng)用對(duì)Ag₂S NDs進(jìn)行表面修飾，使其與腫瘤等目標(biāo)組織具有親和力。已知心肌事件期間，血管緊張素-腎素系統(tǒng)的血管緊張素受體1（AT1R）在心肌中過表達(dá)，為實(shí)現(xiàn)選擇性靶向缺血心肌組織提供了可能。AT1R的天然配體是血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），Dvir等人通過將納米尺寸的PEG化脂質(zhì)體連接到AngⅡ并搭載有機(jī)染料DyLight649，在梗塞后24h獲得了小鼠梗塞心臟的離體熒光圖像。AngⅡ-Ag₂S NDs也成功用于NIR-Ⅱ熒光成像離體Langendorff模型的心肌梗塞，證明AngⅡ的功能修飾有望實(shí)現(xiàn)心臟病發(fā)作的快速成像。但離體情況下的有效靶向性不代表其在體內(nèi)同樣具有適用性。當(dāng)進(jìn)行全身靜脈注射的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，蛋白冠的形成也會(huì)影響AngII-Ag₂S NDs的靶向能力。此外梗塞心肌組織的有效積聚還需要其他器官（如肝臟和腎臟）對(duì)AngII-Ag2SNDs的保留或清除作用最小化。

 本研究使用AngII-Ag2S NDs在心肌梗塞后的短時(shí)間（幾分鐘）內(nèi)對(duì)心臟進(jìn)行NIR-Ⅱ體內(nèi)成像。進(jìn)一步時(shí)程分析評(píng)估靜脈注射后缺血心肌組織中AngⅡ-Ag₂S NDs的選擇性積累速度。比較AngII-和PEG-功能化的Ag₂S NDs的生物分布模式，評(píng)估了AngII-Ag2S NDs的選擇性。

  結(jié)果

 圖1a為研究方法示意。結(jié)扎小鼠的冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）30min誘導(dǎo)心肌梗塞，然后再灌注30min，引發(fā)受影響心肌組織中AT1R受體顯著過表達(dá)（圖1a）。再灌注后立即靜脈注射AngII-Ag₂S NDs（100μL，1.5mg mL^-1，眶后）。圖1b為AngII-Ag₂S NDs的透射電子顯微鏡（TEM）照片。通過1200nm光監(jiān)控AngII-Ag₂SNDs與受損心肌組織的結(jié)合（圖1c），808nm二極管激光器以相對(duì)低功率密度（0.2W·cm^-2）照射，InGaAs紅外照相機(jī)收集和記錄Ag₂SNDs產(chǎn)生的熒光。在靜脈注射后的第一個(gè)小時(shí)內(nèi)，每5min獲取一次熒光圖像。非靶向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)采用PEG化的Ag₂S納米粒子（PEG-Ag₂S NDs）。兩種納米粒子表面修飾不同，但流體動(dòng)力學(xué)半徑非常相似，接近10nm（圖1d，e），且已知這兩種不同的功能化不會(huì)在粒子的發(fā)射光譜中產(chǎn)生任何相關(guān)變化。



  圖1（a）體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)程序示意圖。（b）Ag₂S NDs透射電子顯微鏡圖像。（c）790nm光激發(fā)下Ag₂S NDs膠體懸浮液的發(fā)射光譜。（d，e）分別是AngII化和PEG化的Ag₂S NDs的DLS圖。

  圖2a為靜脈注射Ag₂S NDs后10min（誘導(dǎo)梗塞后40min）獲得的小鼠體內(nèi)光學(xué)圖像、NIR-Ⅱ熒光圖像及融合圖像。包括進(jìn)行梗塞手術(shù)并注射AngII-Ag₂S NDs（上）、手術(shù)并注射非靶向PEG-Ag₂S NDs（中），以及假手術(shù)（無梗塞）并注射靶向AngII-Ag₂S NDs（下）后獲得的NIR-II熒光圖像。可見上行顯示AngII-Ag₂SNDs在梗塞心臟優(yōu)先積聚。相反，在沒有梗塞或使用PEG-Ag₂S NDs時(shí)，由于納米顆粒在肝臟中的滯留，在腹部有優(yōu)先積累。圖2a的NIR-Ⅱ熒光圖像顯示AngII-Ag₂S NDs具有體內(nèi)靶向能力，及其對(duì)急性損傷心肌組織的優(yōu)先粘附。結(jié)果表明靜脈注射后，AngII-Ag₂S納米顆粒僅優(yōu)先積聚在受損的心肌組織中，此時(shí)AngII為其表面配體。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明在沒有靶向或沒有心肌梗塞的情況下，心臟中不會(huì)發(fā)生積聚。

 進(jìn)行時(shí)程研究以評(píng)估優(yōu)先靶向受損心肌的速度。圖2b為靜脈注射AngII-Ag₂S NDs后，三只誘發(fā)梗塞的小鼠心臟和肝臟中產(chǎn)生的NIR-Ⅱ熒光的平均時(shí)間演變，顯示AngII-Ag₂S NDs快速積聚于梗塞心臟。且積聚主要在靜脈注射后的qian10min內(nèi)產(chǎn)生。圖2b包括肝臟中積累的Ag₂S NDs產(chǎn)生的NIR-Ⅱ熒光信號(hào)的時(shí)間演變。與在心臟觀察到的情況相反，肝臟產(chǎn)生的NIR-Ⅱ熒光信號(hào)隨時(shí)間單調(diào)下降，表明肝臟最初的滯留可能隨后逐漸釋放。圖2c為三只急性梗塞小鼠靜脈注射PEG-Ag₂S NDs后，心臟和肝臟累積產(chǎn)生的NIR-Ⅱ熒光強(qiáng)度的時(shí)間演變。這種情況下兩器官產(chǎn)生的NIR-Ⅱ強(qiáng)度的時(shí)間演變模式*不同。肝臟優(yōu)先滯留，即使時(shí)間很短。靜脈注射后肝臟產(chǎn)生的NIR-Ⅱ強(qiáng)度幾乎保持不變，表明PEG-Ag₂S NDs在肝臟長期滯留。同時(shí)，心臟處沒有觀察到顯著的優(yōu)先積累。注射后短時(shí)間內(nèi)，PEG-Ag₂SNDs經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)在心臟中。然而PEG-Ag₂S NDs在心臟中產(chǎn)生的NIR-Ⅱ熒光隨時(shí)間單調(diào)減少。圖2d為假手術(shù)組的時(shí)間進(jìn)程，顯示AngII-Ag₂S NDs在肝臟積累，且信號(hào)隨時(shí)間持續(xù)下降。短時(shí)間內(nèi)在心臟中觀察到的最小信號(hào)也隨時(shí)間快速降低。表明在健康心臟中，AngII-Ag₂S NDs的積累可以忽略不計(jì)，也證明當(dāng)沒有發(fā)生心肌梗塞時(shí)，AngII-Ag₂SNDs清除良好。圖2b-d的時(shí)間曲線不僅揭示AngII-Ag₂S NDs在急性心臟病發(fā)作后選擇性靶向受損心肌的適用性，此外短時(shí)間內(nèi)（射后10min）即出現(xiàn)選擇性積聚，足以觀察到來自缺血心肌組織的清晰和特異性信號(hào)，證明了其快速診斷的能力。



  圖2 （a）三種情況下的光學(xué)、NIR-Ⅱ熒光和融合圖像。（b）急性梗塞并靜脈注射AngII-Ag₂S NDs后，三只小鼠心臟和肝臟中的平均NIR-Ⅱ發(fā)光強(qiáng)度的時(shí)間過程。（c）急性梗塞并靜脈注射PEG-Ag₂S NDs后，心臟和肝臟的平均NIR-Ⅱ發(fā)光強(qiáng)度時(shí)間進(jìn)程。（d）非梗塞并注射AngII-Ag₂S NDs后，心臟和肝臟的平均NIR-Ⅱ發(fā)光強(qiáng)度時(shí)間過程。

 缺血小鼠和假手術(shù)小鼠靜脈注射AngⅡ-Ag₂S NDs后，記錄股動(dòng)脈產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度的時(shí)間演變以評(píng)估粒子循環(huán)時(shí)間特征。兩種情況下，由血流中循環(huán)的AngII-Ag₂S NDs產(chǎn)生的NIR-Ⅱ熒光表現(xiàn)出持續(xù)約2min的初始增量，與注射的NDs*匯入血流中所需的時(shí)間相關(guān)。2min以后兩種情況下都觀察到強(qiáng)度單調(diào)下降。反映了NDs的循環(huán)時(shí)間有限，且與心肌是否有損傷無關(guān)。兩種情況下評(píng)估的衰變時(shí)間都是500s。因此可得出結(jié)論，不管心肌有無損傷，AngⅡ-Ag₂S NDs的循環(huán)時(shí)間約20min。
  為進(jìn)一步證實(shí)圖2a中心肌檢測(cè)到的體內(nèi)NIR-Ⅱ熒光信號(hào)與Ag₂S NDs的存在明確相關(guān)，在注射納米顆粒后1h處死動(dòng)物，立即解剖心臟并通過NIR-Ⅱ光譜成像進(jìn)行分析。圖3a為1000、1200和1500nm處獲得的體外心臟發(fā)光圖像。梗塞+AngⅡ-Ag₂S組（圖3a上）中，1000nm和1500nm都沒有觀察到發(fā)光，1200nm處的熒光圖像顯示心臟頂部產(chǎn)生清晰信號(hào)，該處心肌組織損傷最嚴(yán)重。而1200nm處檢測(cè)到熒光表明發(fā)光對(duì)比度是由AngⅡ-Ag₂S NDs提供的。圖3b為心臟頂部區(qū)域的發(fā)射光譜，與膠體懸浮液中Ag₂SNDs的發(fā)射光譜匹配良好（圖1c），表明觀察到的發(fā)光可歸因于AngⅡ-Ag₂S NDs對(duì)缺血心肌的選擇性附著。梗塞+PEG-Ag₂S組（圖3a中）中，1200nm處僅觀察到非常微弱的信號(hào)，表明NDs的積累很少。圖3b數(shù)據(jù)顯示該情況下的發(fā)射光譜是以1200nm為中心的寬帶，這可能是缺血心肌組織中存在少量PEG-Ag₂S NDs，似乎是缺血心肌組織滲透性和滯留效應(yīng)（EPR）增強(qiáng)所致。最后，未梗塞+AngⅡ-Ag₂S NDs組（圖3a下）同樣在1000和1500nm處沒有觀察到信號(hào)，且1200nm處獲得的熒光圖像勉強(qiáng)高于背景。圖3b中的光譜與Ag₂S NDs的發(fā)射光譜不相似，表明在健康心臟中的累積可以忽略不計(jì)，同時(shí)為了增加AT1R的表達(dá)和累積，缺血事件是必要的。

 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，證實(shí)對(duì)照心臟（假手術(shù)）沒有顯示損傷，梗塞的心臟的損傷組織主要位于jianduan。

 為進(jìn)一步分析梗塞的存在和AT1R的過表達(dá)的關(guān)聯(lián)，對(duì)梗塞心臟樣本進(jìn)行qt-PCR。圖3c為健康心臟（假手術(shù)心臟）和梗塞心臟的AT1R表達(dá)百分比?？梢娂偈中g(shù)組呈現(xiàn)AT1R低表達(dá)，而受損心肌組中顯著升高。將圖3c數(shù)據(jù)與圖3b中的發(fā)射光譜的積分強(qiáng)度相關(guān)聯(lián)（圖3d），顯示了AngII-Ag₂S NDs用于檢測(cè)缺血心肌的靶向效率，以及量化信息。圖3c中可見梗塞引發(fā)的AT1R表達(dá)的相對(duì)增加小于50%，而與AngII-Ag₂S NDs選擇性積累相關(guān)的NIR-Ⅱ熒光信號(hào)顯示增加了10倍，再次反映出AngII-Ag₂S NDs在短循環(huán)時(shí)間內(nèi)的高效靶向性。



  圖3（a）三種不同發(fā)射波長（1000、1200和1500nm）下的離體熒光圖像，對(duì)應(yīng)不同處理組。（b）對(duì)應(yīng)的發(fā)射光譜。（c）假手術(shù)小鼠和心肌梗塞小鼠心肌組織中AT1R的mRNA水平。（**p < 0.01）。（d）健康心臟（假+ AngII-Ag2S）、靜脈注射PEG-Ag₂S NDs后的梗塞心臟（梗塞+PEG-Ag₂S）和靜脈注射AngII-Ag₂S NDs后的梗塞心臟在1000-1600nm范圍內(nèi)的發(fā)射強(qiáng)度。
  最后通過評(píng)估生物分布模式，研究了AngII-Ag₂S NDs的AT1R靶向能力。獲得三種情況下各器官的NIR-Ⅱ發(fā)光圖像（圖4），顯示PEG-Ag₂S NDs優(yōu)先在肝臟和脾臟中積累，而其他器官?zèng)]有出現(xiàn)明顯的紅外發(fā)光。無梗塞的對(duì)照組中也觀察到肝臟和脾臟積聚。而在梗塞后注射AngII-Ag₂S NDs的小鼠器官中，僅在心臟和肺中可見發(fā)光，沒有觀察到肝或脾對(duì)AngII-Ag₂SNDs的實(shí)質(zhì)性保留，與圖2b數(shù)據(jù)非常一致。但對(duì)每個(gè)器官中的發(fā)光進(jìn)行單獨(dú)定量證明有殘余發(fā)光信號(hào)，證實(shí)肝臟和腸道中均存在Ag₂S NDs。生物分布模式（圖4b,c）顯示，對(duì)于梗塞和健康心臟，一些熒光是從肝臟、脾臟和腸道產(chǎn)生的。然而以圖4a中最大強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化后，很難直接觀察這些特定器官的熒光。分析肝臟和腸的離體熒光圖像表明，PEG-和AngII-功能化的Ag₂S NDs通過膽汁途徑和糞便排泄優(yōu)先清除，與已有研究結(jié)論一致。肺中AngⅡ-Ag₂SNDs的積聚可解釋為肺泡-毛細(xì)血管屏障功能障礙，這可能導(dǎo)致肺充血。此外，即使使用傷害最小的huxiji，機(jī)械通氣可能也會(huì)引發(fā)huxiji引起的肺損傷（VILI）。肺血管緊張素受體的上調(diào)可能是炎癥反應(yīng)的一部分。

 
 圖4（a）不同處理小鼠解剖離體器官的NIR-Ⅱ熒光圖像。（b）急性梗塞后靜脈注射PEG-Ag₂S NDs和（c）AngII-Ag2SNDs，在不同器官中產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度直方圖。

 結(jié)論

 本研究使用近紅外二區(qū)發(fā)光的Ag₂S NDs實(shí)現(xiàn)了急性梗塞后快速、高選擇性的體內(nèi)心臟成像。結(jié)果證明急性梗塞后AT1R受體的過表達(dá)可使靜脈注射的AngII-Ag₂S NDs瞬時(shí)（< 10min）并選擇性靶向缺血心肌組織，使得在最早的時(shí)間內(nèi)對(duì)急性梗塞損傷心臟進(jìn)行體內(nèi)可視化成為可能。與離體器官光譜圖像的比較再次證明了AngII-Ag₂S納米粒子的高特異性，即使全身注射也能附著到缺血性心肌組織。

 本研究介紹的近紅外二區(qū)發(fā)光納米粒子可在小動(dòng)物模型中對(duì)急性梗塞后的心臟進(jìn)行快速體內(nèi)成像和診斷。這是臨床前心肌梗塞早期快速診斷的第一步，有助于開發(fā)新的治療方法。此外AngII-Ag₂S NDs的高靶向能力也為新療法開啟了思路，如藥物遞送或利用Ag₂SNDs實(shí)現(xiàn)同時(shí)局部高熱和非接觸式熱傳感。
  參考文獻(xiàn)：Mateos S ,  Lifante J ,  Li C , et al. Instantaneous In Vivo Imaging of Acute Myocardial Infarct by NIR-II Luminescent Nanodots[J]. Small, 2020.