摘要：本文開發(fā)了一種可同時測定葡萄酒中八種真菌毒素的方法，包括黃曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2、展青霉素、嘔吐毒素、赭曲霉毒素 A 以及 玉米赤霉烯酮。在氯化鈉和硫酸鎂存在的條件下，采用乙腈對樣品進行初步提取。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法對得到的提取物進行濃縮，然后進行復(fù)溶，再利用超高效液相色譜 (UHPLC) 三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)模式 (MRM)檢測。結(jié)果表明在紅葡萄酒和白葡萄酒中八種真菌毒素的檢測限 (LOD) 分別在 0.050 至3.3 µg/L 和 0.030 至 8.0 µg/L 范圍內(nèi)，定量限 (LOQ) 分別介于 0.15 至 2.5 µg/L 和 0.10至 25 µg/L 范圍內(nèi)。對于全部八種真菌毒素，在選定的兩個數(shù)量級的基質(zhì)匹配校準范圍內(nèi)線性響應(yīng)良好，線性回歸系數(shù)為 0.995 或更高。對于所測定的兩個加標水平，回收率介于 59.6–132.4%，精密度 (RSD) 介于 1.2–21.1% (n = 6)。其中，大部分加標樣品的回收率為 70%–120%，RSD 小于 10%。本文開發(fā)的方法快速、準確、靈敏，可用于葡萄酒中多種真菌毒素的高通量常規(guī)篩查，并可能擴展到其它發(fā)酵酒類樣品的應(yīng)用中。

前言真菌毒素是由各種真菌在適宜的氣候條件下自我復(fù)制而生成的一系列次級代謝產(chǎn)物。已見諸報道的真菌毒素有 300 余種。研究表明一些真菌毒素會導(dǎo)致多種不良健康效應(yīng)，包括抑制免疫系統(tǒng)，誘發(fā)癌癥及畸形，干擾生長發(fā)育，等等 [1,2]。用于釀酒的農(nóng)產(chǎn)品（例如葡萄）在生長、儲存和加工過程中易感染真菌，進而受到真菌毒素的污染。赭曲霉毒素 A (OTA) 是葡萄酒中最常見的一種真菌毒素 [3-5]。歐盟 (EU) 規(guī)定酒中 OTA 的最高*為 2 µg/L。事實上許多其它的真菌毒素也可能存在于釀造完成的酒中，例如黃曲霉毒素（B1、B2、G1 和 G2），嘔吐毒素 (DON)、玉米赤霉烯酮 (ZEN)、展青霉素 (PAT) [6,7]。一些國家和國際組織已經(jīng)規(guī)定了大多數(shù)原始農(nóng)產(chǎn)品中這類真菌霉素的最高*。但是，這些真菌毒素在酒中的*至今并沒有得到太大的關(guān)注。不同于其它食物商品，酒是一種特殊的飲品，其主要成分為酒精。與真菌毒素自身對人體健康的影響相比，在飲酒的同時攝入真菌毒素可能會加重影響。一篇近期的報道指出，小鼠同時攝入黃曲霉毒素 B1（一種致癌的真菌毒素）及乙醇表現(xiàn)出加合效應(yīng)，會顯著加重對其肝臟的氧化損傷 [8]。與其它食品相比，人體對酒中某些真菌毒素的耐受性可能較低，因此，需要建立一種靈敏可靠的方法對酒中的潛在真菌毒素進行常規(guī)篩查，以確保消費者的安全。對酒中的潛在真菌毒素進行常規(guī)篩查以確保安全性。高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC-ESI-MS/MS)，結(jié)合多種預(yù)提取技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于檢測玉米、飼料、牛奶及草藥等基質(zhì)中的真菌毒素 [9-14]。但是，極少有報道關(guān)注葡萄酒中的多種真菌毒素 [15]。本應(yīng)用簡報基于 UHPLC-ESI-MS/MS 技術(shù)，展示了一種用于快速有效檢測葡萄酒中潛在八種真菌毒素的高通量檢測方法。

實驗部分試劑、化學(xué)品和樣品八種真菌毒素包括展青毒素 (PAT)、嘔吐毒素 (DON)、黃曲霉毒素G1 (AFG1)、黃曲霉毒素 G2 (AFG2)、黃曲霉毒素 B1 (AFB1)、黃曲霉毒素 B2 (AFB2)、赭曲霉毒素 (OTA) 以及玉米赤霉烯酮 (ZEN)（純度大于等于 99%）均購自 Romer 實驗室（澳地利）。甲酸和乙酸銨分別購自美國天地及賽默飛世爾科技公司。紅葡萄酒和白葡萄酒均為進口葡萄酒，從當(dāng)?shù)剡M口商處隨機選擇。真菌毒素化合物的標準溶液制備采用純甲醇配制，儲備溶液濃度為 10 µg/mL，于 –18 °C 下儲存。利用甲醇/水（20:80，體積比）將其稀釋至適當(dāng)濃度用于校正。樣品前處理準確量取葡萄酒樣品 2.5 mL 于離心管中,加入 20 mL 純乙腈 (ACN)混合。然后向離心管中加入氯化鈉 (2 g) 及硫酸鎂 (0.25 g)。對所得混合物渦旋振蕩 3 min 后，在 8000 rpm 下離心 10 min。將占原始體積 80% 的上清液轉(zhuǎn)移至干凈的雞心瓶中，40 °C 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。殘渣用 2 mL 甲醇/水（20:80，體積比）復(fù)溶，并用0.22 µm 膜過濾后，進行 UHPLC-ESI-MS/MS 分析。為了檢驗是否需要進一步凈化，這里分別嘗試了 C18、PSA 和石墨化炭黑 (GCB) 對提取液進行凈化。乙腈提取后所得的上清液均分為三等份加入離心管中，分別與 C18、PSA 和 GCB 混合，持續(xù)振蕩 10 min。將混合物在 8000 rpm 下離心 10 min，所得的上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進一步濃縮。所得殘渣用 2 mL 甲醇/水（20:80，體積比）復(fù)溶，并用 0.22 µm 膜過濾后，進行 UHPLC-ESI-MS/MS分析。使用真菌毒素的回收率評估凈化效率。

基質(zhì)效應(yīng)評價為了驗證紅葡萄酒或白葡萄酒基質(zhì)是否會影響這些真菌毒素檢測的準確度，根據(jù)樣品前處理步驟向葡萄酒中加入一定量的真菌毒素。采用 UHPLC-ESI-MS/MS 分析所得到的樣品。比較每種分析物與相同水平標準溶液中真菌毒素的峰面積。與標準溶液相比，加標基質(zhì)樣品中峰面積比例的降低或增加分別代表基質(zhì)抑制或增強的程度?；|(zhì)匹配的線性校正、檢測限及定量限為了評估線性及檢測靈敏度，選用事先確定無檢測目標分析物的空白基質(zhì)。同樣品一樣，對空白基質(zhì)進行提取和濃縮。所得殘渣使用一系列溶于甲醇/水（20:80，體積比）的真菌毒素標準溶液進行復(fù)溶?；|(zhì)匹配的標準溶液用 0.22 µm 膜過濾后，進行UHPLC-ESI-MS/MS 分析。對每種分析物的峰面積及其濃度進行相關(guān)分析以驗證線性。利用基質(zhì)匹配校準標樣的低濃度樣品生成的S/N，計算所開發(fā)方法的檢出限 (S/N= 3) 及定量限 (S/N = 10)。準確度和精度為了驗證方法的準確度和精密度，向空白基質(zhì)中加入兩個水平的各種真菌毒素作為加標樣品，重復(fù)分析六次。由于葡萄酒、葡萄或其它可參考農(nóng)產(chǎn)品中每種真菌毒素所規(guī)定的*水平相差很大，且每種真菌毒素的質(zhì)譜靈敏度相差也很大，因此將中國法規(guī)中現(xiàn)行最高*水平及其四分之一水平作為每個分析物的加標水平。加標樣品前處理同樣品前處理過程相同，并采用 UHPLC-ESI-MS/MS進行分析。使用六次重復(fù)測定的平均回收率和相對標準偏差評估方法的準確度和精密度。‘

UHPLC-MS/MS 條件整個研究過程中均采用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系統(tǒng)。其包括 1290 Infinity 二元泵、自動進樣器和柱溫箱。采用 AgilentZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 µm）進行八種真菌毒素的分離。流動相是溶液 A 和溶液 B 的在線混合物，其中 A 為純水，B 為含有 5 mmol/L 乙酸銨的甲醇。初始梯度為 10% B，0–2.4 min 內(nèi)線性增加至 42% B，然后在 2.4–6 min內(nèi)持續(xù)增加至 51% B。接著在 6.0–6.2 min 內(nèi)，% B 快速增加至90%，保持 2 min 以確保所有分析物和干擾物質(zhì)可從色譜柱中洗脫出來。流速為 0.4 mL/min，進樣量為 5 µL，柱溫為 40 °C。兩次連續(xù)分析間的柱平衡時間設(shè)置為 1 min。UHPLC 系統(tǒng)的洗脫液由射流電噴霧 (JetStream ESI) 離子源直接進入 Agilent 6460 三重四極桿 MS/MS 系統(tǒng)，并在多反應(yīng)監(jiān)測模式 (MRM) 下進行檢測。正 (pos) 和負 (neg) 模式下的一般離子源參數(shù)如下：毛細管電壓，3500 V (pos)，2000 V (neg)；噴嘴電壓，500 V (pos)，1900 V (neg)；干燥氣溫度，325 °C；干燥氣流速，6 L/min；霧化氣壓力，45 psi；鞘氣溫度，350 °C；鞘氣流速，11 L/min。針對每種化合物優(yōu)化毛細管出口電壓和碰撞能量。

結(jié)果與討論離子模式的選擇及多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)的優(yōu)化在所研究的八種真菌毒素（圖 1）中，PAT、DON、OTA 和 ZEN含有羥基、酚羥基或羰基配體，較易在 ESI 過程中丟失質(zhì)子，因此需要在負離子模式下進行分析以獲取高靈敏度。相反，黃曲霉毒素含有羰基和甲氧基配體，較易在 ESI 過程中獲得質(zhì)子，因此在正離子模式下分析可以獲取較高的靈敏度。在所選擇的離子模式下，利用 6460 三重四極桿 MS/MS 系統(tǒng)分別分析溶于 20% 甲醇水溶液的各種真菌毒素。采用人工或優(yōu)化軟件優(yōu)化每個 MRM 離子對的毛細管出口電壓 (fragmentaor voltage)和碰撞能量 (collision enegy)。毛細管出口電壓由 70 V 掃描至200 V，選擇最高質(zhì)譜響應(yīng)時的電壓作為優(yōu)化值，并用于進一步的碰撞能量選擇。然后利用一系列碰撞能量（CE 由 5 V 至 50 V）裂解分析物。選擇可獲得最高強度和第二高強度碎片的碰撞能量分別作為定量和定性 MRM 離子對的優(yōu)化碰撞能量。優(yōu)化后的參數(shù)列于表 1。

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