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反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣，RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面*被非極性基團所覆蓋，表現(xiàn)出強烈的疏水性。因此，必須用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進行溶質(zhì)的洗脫分離。
反相色譜柱在使用前，醉好進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照C4反相色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是醉佳條件），只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
①醉好使用流動相溶解樣品。
?、谑褂妙A處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
?、凼褂?.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
?、倭鲃酉鄬悠肪哂幸欢ǖ娜芙饽芰ΓＷC樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。
?、诹鲃酉嗯c樣品不產(chǎn)生化學反應c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果;降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。
?、哿鲃酉嗟奈锘再|(zhì)要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，醉好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
④流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實驗無法進行。
⑥在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的C4反相色譜柱，要追求醉佳柱效，醉好使用醉佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的C4反相色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。
當選用醉佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間（如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。
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