前言：藥物制劑中添加藥物賦形劑不是因?yàn)槠渚哂兄委熁钚?，而是為了?yōu)化生產(chǎn)過程，幫助提高制劑穩(wěn)定性或生物利用度，并提高患者的可接受性[1]。蔗糖 (C12H22O11) 是制藥行業(yè)中常用的甜味劑，常用于掩蓋口服藥物令人不快的味道，充當(dāng)防腐劑，以及提高液體藥物的粘度。為確保藥物制劑中使用的蔗糖的安全性和質(zhì)量，需要對雜質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確測定。亞硫酸鹽是蔗糖中常見的雜質(zhì)。美國藥典方法 USP43-NF38-6076[2] 介紹了一種使用紫外-可見分光光度法測定蔗糖中總亞硫酸鹽含量的酶解方法。在本研究中，我們將展示 Agilent Cary 3500 紫外-可見分光光度計在根據(jù) USP 方法測定蔗糖中總亞硫酸鹽方面的優(yōu)勢。

實(shí)驗(yàn)部分背景USP43-NF38-6076 方法的原理是，在有氧條件下，亞硫酸鹽被亞硫酸鹽氧化酶氧化，生成硫酸鹽和過氧化氫，如下面的反應(yīng)方程式所示。（亞硫酸鹽氧化酶）SO32– + O2 + H2O SO42– + H2O2 (1)然后，在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 的存在下，生成的過氧化氫被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸過氧化物酶（NADH 過氧化物酶）還原，如下面的方程式 2 所示。（NADH 過氧化物酶）H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+ (2)反應(yīng)中生成的 NAD+ 的量與樣品中亞硫酸鹽的含量成正比。通過測量 340 nm 處的吸光度可以確定 NADH 的消耗量。通過計算空白和樣品反應(yīng)前后的吸光度差值 (A1–A2) 可以確定總亞硫酸鹽濃度。A1 為酶解反應(yīng)開始時的吸光度。A2 為酶解反應(yīng)結(jié)束時的吸光度。為了獲得 ?A亞硫酸鹽，用樣品的吸光度差(A1–A2) 減去空白的吸光度差 (A1–A2)。根據(jù)下面的公式，可以計算亞硫酸鹽濃度（以 SO2 計）[g/L]：C(總 so2) = V × Mol.Wt × ?A亞硫酸鹽 (3) ε × d × v其中：V = 最終體積 [mL]Mol.Wt = SO2 的分子量 [g/mol]ε = NADH 在 340 nm 處的消光系數(shù) = 6300[l × mol–1 × cm–1]d = 光程 [cm]v = 樣品體積 [mL]

實(shí)驗(yàn)部分樣品前處理樣品 1 和樣品 2 溶液：將 2.0 g 蔗糖（Sigma Aldrich，CAS 號57-50-1）溶于 5.0 mL 蒸餾水中，得到最終濃度為 400 mg/mL的樣品 1。使用 2.0 g 市售蔗糖（購自當(dāng)?shù)爻校?，重?fù)上述流程制備得到樣品 2。亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液 (80 ppm SO2)：將 157.5 mg 無水亞硫酸鈉溶于 1.0 L 蒸餾水中，得到最終濃度 0.1575 mg/mL。參比溶液：將 4.0 g 蔗糖（Sigma Aldrich，CAS 號 57-50-1）溶于 5.0 mL 蒸餾水中。加入 0.5 mL 上述亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用蒸餾水將所得溶液稀釋至 10.0 mL。標(biāo)準(zhǔn)溶液：將 1.0 g 檸檬酸加入 1.0 L 容量瓶中，并用 1.0 L 蒸餾水溶解。然后，準(zhǔn)確稱取 800 mg 無水亞硫酸鈉（Merck，CAS 號 7757-83-7）并加入溶液中（最終濃度約 400 mg/L，以 SO2 計）。用適量的 1 g/L 檸檬酸溶液稀釋儲備液，配制多個濃度的亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（0–400 mg/L，表 1）。

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7 個標(biāo)樣各自的濃度如表 1 所示。使用可選的 A g i l e n tOpenLab 軟件和儀器隨附的 Cary 紫外工作站軟件進(jìn)行檢測。OpenLab 提供了有助于滿足 21 CFR Part 11 和附錄 11 數(shù)據(jù)可靠性要求的工具。這些工具包括針對每次更改的可供檢索的審計追蹤。

結(jié)果與討論根據(jù) USP 方法定量分析蔗糖樣品中的總亞硫酸鹽為了根據(jù) USP43-NF38 專論方法測定蔗糖中的總亞硫酸鹽含量 (SO2)，應(yīng)在反應(yīng)開始 (A1) 和結(jié)束 (A2) 時記錄約 340 nm 處出現(xiàn)的最大吸光度。然后從這些值中扣除空白溶液獲得的相應(yīng)值。樣品溶液的吸光度差 (A1–A2) 不應(yīng)超過參比溶液吸光度差的一半。使用 Agilent Cary 3500 紫外-可見分光光度計測得的蔗糖樣品 1和樣品 2 的 ?A亞硫酸鹽分別為 0.0023 Abs 和 0.0044 Abs（表 5）。兩個樣品的 ?A亞硫酸鹽均小于參比的一半，并且在 USP 規(guī)定的可接受范圍內(nèi)。結(jié)果表明，Cary 3500 適用于蔗糖中亞硫酸鹽雜質(zhì)的測定。

標(biāo)準(zhǔn)溶液中總亞硫酸鹽的定量分析Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計可同步測量 8 個樣品池位置（7 個樣品和 1 個參比）。通過在反應(yīng)開始前、反應(yīng)過程中和反應(yīng)結(jié)束后，在 300–400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行 12 次掃描，在相同條件下同時監(jiān)測 7 個標(biāo)樣（圖 2）。同時測量多個樣品/標(biāo)樣的功能消除了環(huán)境和操作人員造成的分析誤差以及由此帶來的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性風(fēng)險。Cary 紫外工作站動力學(xué)應(yīng)用程序使分析人員可以選擇不連續(xù)的波長或特定波長范圍進(jìn)行掃描。使用 Cary 紫外工作站動力學(xué)應(yīng)用程序同時測量 7 個標(biāo)樣各自的吸光度 (A1)。其方式為測量 300–400 nm 范圍內(nèi)的吸光度4 分鐘（12 次掃描）。然后，使用移液器將 20 µL 亞硫酸鹽氧化酶懸液依次加入每個標(biāo)樣中并混合。使用動力學(xué)應(yīng)用程序，通過 45 分鐘內(nèi) 340 nm 處降低的吸光度來監(jiān)測 NADH 的消耗。在反應(yīng)結(jié)束時，使用表 3 中用于測量吸光度 (A1) 的相同參數(shù)（參數(shù) 2）測量標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度 (A2)。使用導(dǎo)出到 MSExcel 的數(shù)據(jù)，按照公式 3 計算總亞硫酸鹽 (SO2)。結(jié)果匯總于表 6 中。

監(jiān)測 NADH 隨時間的消耗情況Cary 紫外工作站動力學(xué)應(yīng)用程序用于監(jiān)測添加亞硫酸鹽氧化酶后 NADH 的消耗情況。儀器同時測量 7 個標(biāo)樣，監(jiān)測 45 分鐘內(nèi)每個標(biāo)樣在 340 nm 處的吸光度（圖 3）。與每個標(biāo)樣單獨(dú)測量，總測量時間需要 5 多個小時相比，這種方法可節(jié)省大量的時間。Cary 3500 具有高數(shù)據(jù)采集速率（多達(dá) 250 個數(shù)據(jù)點(diǎn)/秒）和寬光度測量范圍，不含活動部件。這些功能可確保在所有測量類型下均可采集準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

結(jié)論Cary 3500 多池紫外-可見分光光度計能夠在單次實(shí)驗(yàn)中同步監(jiān)測 7 個標(biāo)樣中 NADH 的消耗情況。與單獨(dú)測量每個標(biāo)樣相比，這種方法可節(jié)省 5 個多小時的測量時間。同步測量還意味著 7 個標(biāo)樣均在相同的條件下進(jìn)行檢測，從而消除了任何測量變量（例如環(huán)境溫度的變化）。根據(jù) USP43-NF38 方法測定了蔗糖中的總亞硫酸鹽含量。同步測量多個樣品能夠盡可能減少環(huán)境、操作人員和儀器引入的誤差，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。可選的 Agilent OpenLab 軟件用于支持?jǐn)?shù)據(jù)采集過程的 Part 11/附錄 11 合規(guī)性。Cary 3500 可通過軟件控制的攪拌功能在整個測量期間混合樣品池中的所有反應(yīng)物。