中性蛋白酶（NP）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1526

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品說(shuō)明:

NP在一定的溫度和中性pH條件下，催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無(wú)毒、水解能力強(qiáng)、作用范圍廣等特點(diǎn)，中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營(yíng)養(yǎng)保健品生產(chǎn)。中性條件下，NP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán)；在680nm有特征吸收峰。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制： 

1. 試劑一：臨用前加入4mL蒸餾水，充分溶解。

2. 試劑二：臨用前加入4mL提取液，沸水浴中攪拌溶解。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：20μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸。

需自備的儀器和用品： 

研缽/勻漿器、臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1.5mLEP管、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

稱約0.1g組織，加入1mL提取液，冰上充分研磨，10000rpm 4℃離心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待測(cè)。或直接稱取0.1g酶制品，加入1mL提取液，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至680nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一、試劑二和試劑三置于30℃水浴保溫30min以上。

3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：臨用前將20μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋80倍至0.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4. 樣本測(cè)定 (1.5mLEP管中分別加入下列試劑) ：

三、NP活性計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1μmol酪氨酸為一個(gè)酶活單位。

NP活性（U/mg prot）=C標(biāo)準(zhǔn)品×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V1÷（Cpr×V2）÷T=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：30℃每克樣本每分鐘催化水解產(chǎn)生1μmol酪氨酸為一個(gè)酶活單位。

NP活性（U/g質(zhì)量）=C標(biāo)準(zhǔn)品×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V1÷（W×V2÷V3）÷T=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液濃度，0.25μmol/mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V1：酶促反應(yīng)總體積，0.1mL；V2：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，20µL=2×10^-2mL；V3：粗酶液總體積，1mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間，10min。

注意事項(xiàng)：

若反應(yīng)較弱，（A測(cè)定管-A對(duì)照管）差值較小，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（20-30min），即第一步水浴時(shí)間，最后計(jì)算酶活時(shí)對(duì)公式進(jìn)行修改。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g兔脾臟加入1mL提取液冰上充分研磨，10000rpm 4℃離心10min，取上清，即粗酶液，置冰上，之后照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.132-0.123=0.009，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.259-0.045=0.214。按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NP活性（U/g質(zhì)量）=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=0.125×0.009÷0.214÷0.1=0.0526 U/g質(zhì)量。