摘要：在本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中，我們展示了利用陰離子交換色譜法，在使用四種不同的高鹽洗脫緩沖液（最大濃度為 2 M）進(jìn)行線性和階梯梯度洗脫條件下，對(duì)四種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的相關(guān)信息。Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)的流路設(shè)計(jì)中未采用鐵/鋼質(zhì)材料，因此可耐受生物分析和生物純化應(yīng)用中的嚴(yán)苛條件，從而保持其出色的 UHPLC 性能。使用四種鹽（氯化鈉 (2 M)、(1 M)、乙酸鈉 (1 M) 和四甲基氯化銨 (1 M)）進(jìn)行線性梯度洗脫時(shí)，均可獲得保留時(shí)間和峰面積精確度。此外，使用 2 M 氯化鈉作為洗脫緩沖液時(shí)，結(jié)果表明保留時(shí)間和分離度可保持穩(wěn)定達(dá) 48 小時(shí)以上。在此類(lèi)條件下，采用不銹鋼材質(zhì)的液相色譜系統(tǒng)會(huì)面臨一些問(wèn)題，例如鹽引起的腐蝕，因此需要執(zhí)行特殊的、繁雜的清洗步驟。使用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)則可以*避免此類(lèi)清洗步驟，從而提高生物分析或生物純化應(yīng)用的通量和效率。

前言在諸如離子交換 (IEX) 或體積排阻色譜(SEC) 法中使用的高鹽流動(dòng)相，對(duì)于不銹鋼材質(zhì)的液相色譜系統(tǒng)而言是一項(xiàng)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。由于長(zhǎng)期使用含鹽緩沖液所引發(fā)的腐蝕效應(yīng)，導(dǎo)致此類(lèi)液相色譜系統(tǒng)存在損壞的風(fēng)險(xiǎn)。其結(jié)果就是需要執(zhí)行繁雜的清洗步驟。因此，強(qiáng)烈建議使用不含鐵的系統(tǒng)，避免受到高鹽濃度的影響。Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)在樣品流路中不含金屬成分。自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和檢測(cè)器流路中所有的毛細(xì)管和接頭均*是不含金屬的，因此，生物分子只與陶瓷或 PEEK 管線接觸。這使得用戶(hù)可以使用高鹽含量的緩沖液。此外，相對(duì)于 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統(tǒng)而言，該系統(tǒng)可在較寬的 pH 范圍（1-13，短時(shí)間分析可以高達(dá) 14）內(nèi)保持穩(wěn)定1。在本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中，以陰離子交換色譜 (AEX)為例，論證了將 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)用于高鹽應(yīng)用的可行性。利用陰離子交換色譜 (AEX) 對(duì)四種蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離，其中使用了四種不同的洗脫鹽：氯化鈉 (2 M NaCl)、 (1 M KCl)、乙酸鈉 (1 M CH3COONa)和四甲基氯化銨 (1 M [(CH3)4N]Cl)。在線性和階梯梯度條件下，分別分析了保留時(shí)間和峰面積的精確度。此外，還使用 2 MNaCl 洗脫緩沖液考察了保留時(shí)間和峰面積的長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定性（48 小時(shí)）。

實(shí)驗(yàn)部分Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)，包括以下模塊：• Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵(G5611A)• Agilent 1260 Infinity 高效生物惰性自動(dòng)進(jìn)樣器 (G5667A)• Agilent 1260 Infinity DAD VL（G1315D，配置生物惰性標(biāo)準(zhǔn)流通池，10 mm）• Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)色譜柱Agilent Bio WAX，NP5，4.6 × 250 mm，PK 色譜柱軟件Agilent OpenLAB CDS ChemStation，LC和 LC & MS 系統(tǒng)版，修訂版 C.01.02 [14]溶劑緩沖液 A： 20 mM Tris，pH 7.6緩沖液 B： 20 mM Tris，pH 7.6 +• 2 M NaCl• 1 M KCl• 1 M CH3COONa• 1 M [(CH3)4N]Cl所有試劑均為液相色譜級(jí)。新制超純水產(chǎn)自配置 0.22 µm 膜式終端過(guò)濾器 (Millipak)的 Milli-Q Integral 水純化系統(tǒng)。Tris 購(gòu)自Fluka 公司（西格瑪奧德里奇，美國(guó)圣路易斯）。NaCl 購(gòu)自 VWR 公司（美國(guó)賓夕法尼亞州拉德諾）。[(CH3)4N]Cl 和 KCl 購(gòu)自 Merck KGaA 公司（德國(guó)達(dá)姆斯塔特）。CH3COONa 購(gòu)自 J.T. Baker 公司（VWR，美國(guó)賓夕法尼亞州拉德諾）。

柱塞桿密封墊清洗液• 100% 超純水• 每 1.5 min 清洗 0.3 min蛋白質(zhì)• 取自馬骨骼肌的肌紅蛋白，17053 Da，pI 6.9 (1 mg/mL)• 取自雞蛋清的伴清蛋白，76000 Da，pI 6.24 及 6.092 (2 mg/mL)• 取自牛奶的 a-乳清蛋白，14175 Da，pI 4.5 (1 mg/mL)• 取自大豆的胰蛋白酶抑制劑，20100 Da，pI 4.5 (1 mg/mL)所有蛋白質(zhì)均購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司（美國(guó)圣路易斯）。

結(jié)果和討論線性梯度陰離子交換色譜，使用 2 M NaCl利用 AEX 在線性梯度條件下，對(duì)四種蛋白質(zhì)的混合物進(jìn)行了分離，緩沖液 B 中使用 2 M NaCl 作為洗脫鹽。圖 1 中所示為線性梯度條件下蛋白質(zhì)的分離色譜圖。蛋白質(zhì)的洗脫順序主要與其等電點(diǎn) (pI) 有關(guān)。其中 a-乳清蛋白及胰蛋白酶抑制劑的分離與蛋白表面的電荷變化有關(guān)，其未必與總凈電荷相等。七次運(yùn)行后測(cè)定其保留時(shí)間和峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，即為精確度。伴清蛋白中存在不同的異構(gòu)體，具體取決于其結(jié)合鐵的量2。因此，選取五個(gè)色譜峰對(duì)保留時(shí)間精確度進(jìn)行評(píng)估。相反的是，伴清蛋白色譜峰不能用于計(jì)算峰面積 RSD，原因在于其異構(gòu)體未能實(shí)現(xiàn)基線分離。所有五個(gè)色譜峰的保留時(shí)間 RSD均小于 0.09 %。所評(píng)估蛋白質(zhì)的峰面積RSD 均小于 1.1%。

陰離子交換色譜，使用不同類(lèi)型的鹽分離度和選擇性受洗脫離子，即鹽類(lèi)型改變的影響3。根據(jù)所分析蛋白質(zhì)的不同，鹽可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)洗脫產(chǎn)生不同的色譜影響。為了找到針對(duì)具體應(yīng)用的最佳洗脫離子，可以對(duì)多種鹽進(jìn)行測(cè)試。如果在一個(gè)序列中需要測(cè)試多于三種鹽類(lèi)型，那么在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中最好選用溶劑選擇閥。在本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中，在洗脫緩沖液中評(píng)估了四種鹽。圖 2、3 和 4 中所示為線性梯度條件下蛋白質(zhì)的分離結(jié)果，分別采用 1 M KCl（圖 2）、1 M CH3COONa（圖 3）和 1 M[(CH3)4N]Cl（圖 4）作為洗脫鹽。并計(jì)算了保留時(shí)間和峰面積的 RSD，其中 n = 7。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)保留時(shí)間、分離度以及峰形和強(qiáng)度的變化與所使用的洗脫鹽有關(guān)。特別是，伴清蛋白 A 和 B 的分離度在使用不同鹽類(lèi)型時(shí)也不同，其中使用 1 M CH3COONa時(shí)的分離度最佳?？紤]到上述所有因素（最佳分離度、最佳峰形和最高強(qiáng)度），且使基線較為平直，則 1 M KCl 是分離四種蛋白質(zhì)的選擇。

階梯梯度使用階梯梯度（特別是只有一種蛋白質(zhì)需要分離時(shí)）可以加速分離過(guò)程，從而降低緩沖液的消耗量。圖 5 和 6 中所示為階梯梯度下的蛋白質(zhì)分離，分別使用了 1 MKCl（圖 5）和 1 M CH3COONa（圖 6）。并計(jì)算了保留時(shí)間和峰面積的 RSD，其中n = 7。由于 AEX 色譜柱所需的平衡時(shí)間較長(zhǎng)，與線性梯度相比，階梯梯度的保留時(shí)間和峰面積精密度略差。此外，在梯度階梯的時(shí)間點(diǎn)可觀察到負(fù)峰，同樣是由于平衡時(shí)間不足引起的。

為了證明在使用高鹽緩沖液條件下保留時(shí)間和分離度的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，以 2 M NaCl作為洗脫鹽對(duì)蛋白質(zhì)分離的情況（線性梯度）進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá) 48 小時(shí)的監(jiān)測(cè)，請(qǐng)參見(jiàn)圖 7 和 8。結(jié)果證實(shí)在整個(gè)時(shí)間段內(nèi)，保留時(shí)間和分離度均保持穩(wěn)定。在所有測(cè)試中，柱塞桿密封墊清洗液（含有 100%水）每 1.5 分鐘啟用一次，清洗 0.3 分鐘，以去除泵柱塞桿上的鹽

結(jié)論本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)論證了 Agilent 1260 Infinity生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)是高鹽應(yīng)用的理想選擇。通過(guò)采用陰離子交換色譜法對(duì)四種不同蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，使用四種不同的洗脫離子/鹽類(lèi)型在線性梯度條件下均可獲得較高的精確度。根據(jù)所使用的鹽類(lèi)型，色譜圖中的保留時(shí)間、分離度、峰形和強(qiáng)度隨之變化。因此，我們建議測(cè)試不同的鹽類(lèi)型，找到最適宜的一種以實(shí)現(xiàn)最佳的樣品分離。如果需要測(cè)試多于三種鹽類(lèi)型，那么在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中最好選用溶劑選擇閥。當(dāng)使用 2 M NaCl 作為蛋白質(zhì)分析的洗脫鹽時(shí)，結(jié)果證實(shí)保留時(shí)間和分離度可在超過(guò) 48 小時(shí)的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。采用階梯梯度可縮短分離時(shí)間，并降低緩沖液消耗。但是，需要考慮的是色譜柱需要更長(zhǎng)的平衡時(shí)間。因此，強(qiáng)烈建議在每次分析之間留有足夠的平衡時(shí)間，不論使用的是線性還是階梯梯度。另外一個(gè)要點(diǎn)是定期（例如，每 1.5 分鐘清洗 0.3 分鐘）進(jìn)行密封墊清洗（含有 100% 水），以去除泵柱塞桿上的鹽。在高鹽應(yīng)用中，Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)和 Agilent BioWAX，NP5，4.6 x 250 mm，PK 色譜柱均表現(xiàn)出了保留時(shí)間和分離度穩(wěn)定性