摘要：食品添加劑，如抗氧化劑和防腐劑的添加，可以延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。在本文中，我們描述了一種定量分析橙汁中抗氧化劑和防腐劑（檸檬酸、苯甲酸）的方法。該方法的開(kāi)發(fā)是通過(guò)采用配備 Agilent Poroshell EC-C18 色譜柱的 Agilent 1260 Infi nity LC 系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)樣品分析進(jìn)行部分方法學(xué)驗(yàn)證，證明其線性、穩(wěn)定性，以及峰面積和保留時(shí)間的精密度符合要求。該方法中苯甲酸的檢測(cè)限為 0.2 µg/mL。在樣品回收率的研究中，所有化合物的回收率都大于 90%。該方法通過(guò)采用 Agilent 1290 Infi nity LC 系統(tǒng)可有效地轉(zhuǎn)換成一個(gè)快速的超高效液相色譜（UHPLC）方法。新方法分析速度比原方法快5 倍，并且苯甲酸的檢測(cè)限不變。兩種方法都能被食品制造商有效采用，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品添加劑的質(zhì)量控制。

引言抗氧化劑，如抗壞血酸的抗氧化作用是通過(guò)減少環(huán)境中的氧來(lái)實(shí)現(xiàn)的。抗壞血酸優(yōu)先被氧化并生成去氫抗壞血酸（DHA），從而防止了基質(zhì)的氧化。防腐劑，如檸檬酸或苯甲酸防止或抑制食品中微生物的生長(zhǎng)。在一些水果中天然含有抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸[1]，額外添加這些成分可延長(zhǎng)果汁的保質(zhì)期。雖然果汁中苯甲酸的含量法規(guī)限值為 400 µg/mL 到 600 µg/mL，但我們更加關(guān)注的是由苯甲酸和抗壞血酸在一定條件下反應(yīng)生成的致癌物質(zhì)苯[2,3]。據(jù)報(bào)道，抗壞血酸的含量隨時(shí)間、溫度和其他因素變化而減少并最終生成 DHA。AOAC 方法 967.22 中檢測(cè)分析含量的方法是首先氧化抗壞血酸生成 DHA，然后再進(jìn)行衍生和熒光檢測(cè)。對(duì)于 UV 分析，DHA 在波長(zhǎng) 220 nm 以上紫外吸收很小，而抗壞血酸在 244–265 nm 波長(zhǎng)處有紫外吸收（取決于緩沖液的 pH值[5]）。AOAC 方法 994.11 采用 UV 檢測(cè)分析橙汁中的苯甲酸。本文運(yùn)用簡(jiǎn)單的樣品提取步驟并采用 UV 檢測(cè)器對(duì)抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸進(jìn)行定量分析。

試劑和化學(xué)品所有試劑和溶劑均為 HPLC 級(jí)。高純水由 Milli Q 水凈化系統(tǒng)制備（Millipore Elix 10，美國(guó)）。梯度使用的乙腈購(gòu)自 Lab-Scan 公司（泰國(guó)），磷酸二氫鉀購(gòu)自 Fluka公司（德國(guó)）。磷酸購(gòu)自 Fluka 公司（瑞士）?？箟难?、檸檬酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司（印度）。購(gòu)買(mǎi)在印度生產(chǎn)的國(guó)際品牌橙汁。

實(shí)驗(yàn)部分儀器及軟件Agilent 1260 Infi nity 二元液相色譜系統(tǒng)由以下幾個(gè)模塊組成：• Agilent 1260 Infi nity 二元泵（G1312B）• Agilent 1260 Infi nity 自動(dòng)進(jìn)樣器和恒溫器（G1367E, G1330B）• Agilent 1260 Infi nity 柱溫箱（G1316A）• Agilent 1260 Infi nity 二極管陣列檢測(cè)器 （G4212B）配備 10 mm 最大光強(qiáng)流通池采用 Agilent 1290 Infi nity LC 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了UHPLC 分析的開(kāi)發(fā)和運(yùn)行。該系統(tǒng)由以下幾個(gè)模塊組成：• Agilent 1290 Infi nity 二元泵（G4220A）• Agilent 1290 Infi nity 自動(dòng)進(jìn)樣器和恒溫器（G4226A, G1330B）• Agilent 1290 Infi nity 柱溫箱（G1316C）• Agilent 1290 Infi nity 二極管陣列檢測(cè)器（G4212A）配備 10 mm 最大光強(qiáng)流通池色譜柱：• Agilent Poroshell 120 EC-C18,4.6×100 mm，2.7 µm （部件號(hào)697975-302）工作站軟件：• B.04.02 版 Agilent ChemStation 工作站

色譜參數(shù)反相液相色譜法和 UHPLC 法的色譜參數(shù)見(jiàn)表 1。標(biāo)準(zhǔn)品制備準(zhǔn)確稱(chēng)取抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸，用流動(dòng)相 A 分別配制濃度為 5000 µg/mL（ppm）、50000 ppm 和 100 ppm 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。超聲 10 min 使苯甲酸溶解*。用流動(dòng)相 A 依次稀釋上述三種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成線性濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，見(jiàn)表 2。pH 值 2.5 的流動(dòng)相A能防止抗壞血酸的電離。樣品制備將適量的磷酸滴加到 5 mL 橙汁中，調(diào)節(jié)其 pH 值到 2.5 并渦旋混合。樣品溶液在1897×g 離心力下離心 5 min，通過(guò) 0.2 µm安 捷 倫 再 生 纖 維 素 濾 膜 過(guò) 濾（部 件 號(hào)5185-5830）。過(guò)濾后的樣品溶液直接用于樣品分析。步驟5 µL 流動(dòng)相 A 作為空白進(jìn)樣分析，每個(gè)線性濃度水平重復(fù)分析六次。每個(gè)濃度水平的峰面積和保留時(shí)間的數(shù)據(jù)被用于計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。根據(jù)苯甲酸低線性濃度進(jìn)樣計(jì)算其檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）。確定線性濃度之前，進(jìn)樣分析萃取后的橙汁樣品以測(cè)定其中抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸的大致濃度。以每個(gè)線性濃度水平的平均峰面積對(duì)溶液濃度作圖得線性曲線

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進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)時(shí)，將橙汁的 pH 值調(diào)節(jié)到 2.5。添加高濃度和低濃度的檸檬酸和苯甲酸到橙汁中，配制成高濃度和低濃度的加標(biāo)樣品。高濃度和低濃度加標(biāo)樣品的差異用于回收率計(jì)算。為評(píng)價(jià)該方法的耐用性，改變了四個(gè)關(guān)鍵的方法參數(shù)——流速 ± 2%、TCC 溫度± 5%、進(jìn)樣量 ± 5% 和波長(zhǎng) ± 3%。針對(duì)每一個(gè)變動(dòng)，重復(fù)進(jìn)樣分析濃度分別為 108 ppm、7000 ppm 和 5 ppm 的檸檬酸和苯甲酸混合加標(biāo)樣品七次。分析了三種不同品牌橙汁中該三種酸性物質(zhì)的含量。隨后將該方法成功轉(zhuǎn)換成一個(gè) UHPLC 方法。評(píng)估每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的 LOD、LOQ 和線性，同時(shí)用峰面積和保留時(shí)間的 RSD 驗(yàn)證該方法的精密度。

結(jié)果與討論分離與檢測(cè)采用多種色譜柱分離檢測(cè)檸檬酸和苯甲酸。標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相 A 溶解，同時(shí)添加標(biāo)準(zhǔn)品到橙汁中，配制成加標(biāo)樣品用以測(cè)試基質(zhì)干擾。安捷倫苯基-己基柱和 Poroshell EC-C18 色譜柱對(duì)水溶性標(biāo)準(zhǔn)品具有良好的分離性能。Agilent Poroshell EC-C18 色譜柱被用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。在一個(gè)低的 TCC 溫度和60% 甲醇 – 40% 乙腈的流動(dòng)相 B 下，標(biāo)準(zhǔn)品峰與基質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)了良好的分離。pH 值 2.5 時(shí)，游離型抗壞血酸在波長(zhǎng)243.5 nm 處具有最大的紫外吸收。在這個(gè)波長(zhǎng)下基質(zhì)吸收較少，所以能簡(jiǎn)單地定量分析抗壞血酸。在波長(zhǎng) 210.0 nm 處檢測(cè)檸檬酸，而在波長(zhǎng) 230.0 nm 處檢測(cè)苯甲酸。因?yàn)榭箟难嵩诘蜏叵路€(wěn)定，所以在整個(gè)分析過(guò)程中，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度一直恒定在 4 °C。Margolis 等人[6] 報(bào)道指出當(dāng)抗壞血酸儲(chǔ)存在自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中 22h 后，其濃度會(huì)顯著下降。結(jié)果顯示，在不同批次的自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中抗壞血酸的濃度損失可高達(dá) 89%。然而，Margolis 的研究表明樣品瓶在經(jīng)過(guò)酸堿清洗后，抗壞血酸的最大損失只有 4%。

在本研究中，測(cè)試了三種不同的樣品瓶：• MS 校驗(yàn)樣品瓶 （p/n 5190-2280）• ALS 樣品瓶 （p/n 5182-0716）• 經(jīng)酸堿清洗的 ALS 樣品瓶校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存于緩沖溶液中，并放置于4 °C 的 ALS 恒溫箱中，16h 后在所有三種樣品瓶的樣品中，抗壞血酸的峰面積損失為 3%，而檸檬酸和苯甲酸的峰面積損失均小于 1%。本研究表明這三種樣品瓶都可以用于本分析。在本應(yīng)用報(bào)告中，使用的是 MS 校驗(yàn)樣品瓶。圖1展示了采用Agilent 1260 Infi nity LC 系統(tǒng)分離抗壞血酸、檸檬酸和苯甲酸的色譜圖。一步升至25% 流動(dòng)相 B 的梯度程序?qū)τ趶幕|(zhì)中洗脫出苯甲酸峰非常必要。維持高比例的有機(jī)相 13 min 以上，可確保*去除來(lái)自橙汁的基質(zhì)峰。