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人臍靜脈細(xì)胞HUVEC的實(shí)驗(yàn)步驟是怎樣的？
人臍靜脈細(xì)胞HUVEC是從臍帶組織中分離出來(lái)的；它是臍帶的重要結(jié)構(gòu)細(xì)胞之一，在人體的正常生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。臍帶是連接哺乳動(dòng)物的胎兒和胎盤(pán)的管狀結(jié)構(gòu)。臍帶中穿過(guò)尿道膜的血管是臍動(dòng)脈和臍靜脈，卵黃囊中的血管是臍腸系膜動(dòng)脈和臍腸系膜靜脈。在子宮內(nèi)，來(lái)自胎盤(pán)母親部分的子宮動(dòng)脈的毛細(xì)血管與胎盤(pán)女兒部分的胎兒毛細(xì)血管接近，母親和胎兒的血液在這里進(jìn)行二氧化碳和氧氣的交換，代謝物是代謝廢物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。臍動(dòng)脈將胎兒產(chǎn)生的廢物輸送到胎盤(pán)，而臍靜脈將O2和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從胎盤(pán)輸送到胎兒體內(nèi)。
人臍靜脈細(xì)胞HUVEC是通過(guò)胰蛋白酶膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差異化粘附法制備的，并在內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基中進(jìn)行了培養(yǎng)和篩選。細(xì)胞總數(shù)約為5×10^5個(gè)/瓶；細(xì)胞經(jīng)CD31/vWF免疫熒光鑒定，純度達(dá)90%以上，無(wú)HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
人臍靜脈細(xì)胞HUVEC的實(shí)驗(yàn)步驟
1、將15-20cm長(zhǎng)的新生兒臍帶放入無(wú)菌PBS溶液中保存。(注意：在4℃下最多可保存24小時(shí)，室溫下可保存6小時(shí)，否則將被丟棄）。
2、將鈍針插入臍靜脈管，用無(wú)菌PBS液沖洗3-5次，直至污染的血液干凈。
3、用手術(shù)鉗夾住臍帶下端，加入15ml膠原酶（1mg/ml）在室溫下消化15-20分鐘，并不時(shí)上下?lián)u晃臍帶。
4、消化結(jié)束后，松開(kāi)下面的手術(shù)鉗，將消化液流入50ml無(wú)菌離心管，用無(wú)菌PBS溶液沖洗臍帶2-3次。
5、將收集的溶液離心（2000rpm）3分鐘。
6、取出上清液，加入10mlM199培養(yǎng)基（加入10U/ml的bFGF），用肘部吹去細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)移到用明膠包裹的培養(yǎng)瓶中，在37℃下培養(yǎng)（注：每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入3-4ml無(wú)菌1%明膠溶液，搖勻使明膠溶液*覆蓋瓶底，37℃下培養(yǎng)至少2小時(shí)。使用前倒掉明膠溶液。明膠涂層有利于細(xì)胞壁的粘附）。
7、培養(yǎng)24小時(shí)后，倒出培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS溶液洗2-3次，洗去紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入10ml新鮮M199培養(yǎng)基。
8、每2天更換一次培養(yǎng)基（每次更換2/3的培養(yǎng)基）。
9、一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)5-7天的培養(yǎng)，細(xì)胞可以生長(zhǎng)到80-90%的單層，可以傳代。
10、人臍靜脈細(xì)胞HUVEC倒出培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS溶液洗2-3次，加入2-3毫升消化液（0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察。一旦細(xì)胞變圓，加入2-3次含血清的DMEM培養(yǎng)基以停止反應(yīng)。
11、用肘部吹干細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml無(wú)菌離心管中，2000rpm，離心3分鐘。
12、倒出上清液，加入10毫升新鮮培養(yǎng)基。一般來(lái)說(shuō)，3-4瓶細(xì)胞可以在一個(gè)瓶子里進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后像這樣進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
13、一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)2-3代（約20天）進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。
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