手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
(一)獲得目的基因
1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點)，PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環(huán)獲得產物。
(二)構建重組表達載體
1、熒光素標記的生物素載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
(三)獲得含重組表達質粒的表達菌種
1、將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。
2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3、以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。
(四)誘導表達
1、熒光素標記的生物素挑取含重組質粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6，大約需3hr)。
3、取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻，70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。
相關產品
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：化工儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發(fā)表之日起一周內與本網聯系，否則視為放棄相關權利。
采購中心