ATP酶法冰凍切片人體肌肉組織分型染色試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

 ATP酶法冰凍切片人體肌肉組織分型染色試劑是一種旨在使用鈣激活技術(shù)，在堿性或酸性條件下，由三磷酸腺苷酶催化水解產(chǎn)生的磷酸與鈣離子結(jié)合，經(jīng)過氯化鈷的替換，最后在硫化銨存在的情況下，呈現(xiàn)組織樣本中酶活性部位的不同深淺棕色沉淀現(xiàn)象的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于人體組織冰凍切片的酶活性檢測，即人體肌肉組織纖維的分型鑒定。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，靈敏牢固，顯色清晰。

技術(shù)背景

三磷酸腺苷酶或ATP酶（adenosinetriphosphatase；ATPase）可催化ATP水解生成ADP及無機(jī)磷的反應(yīng)，這一反應(yīng)放出大量能量，用于運(yùn)送離子進(jìn)出細(xì)胞，同時供給生物體進(jìn)行需能生命過程。它存在于生物細(xì)胞的多個部位，比如肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜上，對整個生命的維持有著重要的作用。其中骨骼肌受到神經(jīng)沖動的刺激，肌漿內(nèi)鈣離子濃度升高，肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵ATP酶（sarcoplasmic or endoplasmic reticulum calcium ATPases；SERCA）激活，分解ATP釋放能量，肌肉收縮。人類肌肉由兩種纖維構(gòu)成，即I型或紅肌，又稱為慢纖維（slow twitch），和II型或白肌，又稱為（fast twitch）。I型和II型肌纖維混合鑲嵌排列成“棋盤樣（checkerboard）”結(jié)構(gòu)。在身體里，I型和II型纖維的比例取決于肌肉在機(jī)體中的位置和它的功能，相較于II型肌，I型肌的肌球蛋白含量高，線粒體多，毛細(xì)血管密度高，糖原低，適合于有氧呼吸，持久收縮。一般的肌肉，其纖維分布是II型纖維（60至65%）2倍于I型纖維。通過ATP酶染色，可以顯示兩型肌纖維，輔助診斷神經(jīng)源性肌、脊髓性肌肉等。三磷酸腺苷酶（ATP酶）水解三磷酸腺苷為二磷酸腺苷和磷酸，并釋放出能量。磷酸與鈣離子結(jié)合，在酶活性處形成無色的磷酸鈣，磷酸鈣經(jīng)氯化鈷處理形成磷酸鈷，再經(jīng)硫化銨處理形成棕黑色的硫化鈷沉淀在酶活性部位。

產(chǎn)品內(nèi)容

堿性液（Reagent A）                    15毫升

酸性液（Reagent B）                     5毫升

反應(yīng)液（Reagent C）                     1毫升

激活液（Reagent D）                    30毫升

置換液（Reagent E）                    20毫升

清理液（Reagent F）                   250毫升

顯色液（Reagent G）                    10毫升

產(chǎn)品說明書                1份

保存方式

保存反應(yīng)液（Reagent C）和顯色液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

蘇木素復(fù)染試劑盒（HL80067）：用于選擇性染色后復(fù)染

2毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

小型染色缸：用于染色清洗操作

光學(xué)顯微鏡：用于染色后觀察分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent C）置入冰槽里融化，然后移出200微升到2毫升離心管里，加入1.8毫升堿性液（Reagent A），混勻后，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，置于冰槽里備用（注意：5次操作量）。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣本激活處理

1． 取出2片待測的5至10微米厚的冰凍組織切片，標(biāo)記為1和2（注意：參見注意事項(xiàng)3和4）

2． 小心加上200微升堿性液（Reagent A）在1號切片上，鋪滿整個樣品表面（注意：滴液前，用手芯焐熱試劑至室溫）

3． 室溫下孵育2分鐘

4． 同時小心加上200微升酸性液（Reagent B）在2號切片上，鋪滿整個樣品表面

5． 室溫下孵育2分鐘

6． 小心移去2號切片上的酸性液（Reagent B）（注意：滴液前，用手芯焐熱試劑至室溫）

7． 室溫下，小心將2號切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育1分鐘,，期間輕輕攪拌

8． 小心移去1號切片上的堿性液（Reagent A）和2號切片上的清理液（Reagent F）

9． 分別加上200微升反應(yīng)工作液，鋪滿整個樣品表面（注意：滴液前，用手芯焐熱試劑至室溫）

10． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里，孵育30分鐘（注意：如果染色較淺，建議延長時間至60分鐘）

11． 小心移去反應(yīng)工作液

12． 小心加上200微升激活液（Reagent D），鋪滿整個樣品表面

13． 室溫下孵育3分鐘

14． 小心移去 激活液（Reagent D）

15． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟12至14二次

二、樣本染色處理

1． 小心加上200微升置換液（Reagent E），鋪滿整個樣品表面

2． 室溫下孵育3分鐘

3． 小心移去置換液（Reagent E）

4． 室溫下，小心將切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育2分鐘,，期間輕輕攪拌（注意：如果染色出現(xiàn)雜質(zhì)，建議使用無離子水沖洗）

5． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

6． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟4和5一次（注意：清洗不干凈，可見棕黑色殘?jiān)w粒）

7． 小心加上200微升顯色液（Reagent G），鋪滿整個樣品表面

8． 室溫下孵育2分鐘；或持續(xù)孵育直至可見淺棕和深棕色為止（注意：如果染色較淺，建議置于37℃孵育，避免干枯）

9． 小心移去顯色液（Reagent G）

10． 室溫下，小心將切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育2分鐘

11． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

三、 （選擇步驟）樣本復(fù)染處理

1． （選擇步驟）樣本復(fù)染處理（蘇木素）

2． 放上蓋玻片或封片

3． 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時，須帶手套

3． 建議使用異戊烷（isopentane）快速冷凍組織，避免切片冰晶形成

4． 冰凍切片不宜固定和包埋處理；避免干片

5． 試劑溶液在樣品表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿樣品表面

6． 組織細(xì)胞染色注意不要過度

7． 可以使用有機(jī)溶劑（乙醇、二甲苯等）脫水、透明處理后封片 

8． 組織細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，否則會逐漸褪色 

9． ATP酶染色參考圖像：

1）1號切片 

2）2號切

10． 本公司提供系列特定組織染色試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰