朗伯比爾定律(Lambert-Beer law)是分光光度法的基本定律，是描述物質(zhì)對某一波長光吸收的強弱與吸光物質(zhì)的濃度及其厚度間的關(guān)系。

當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時,其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度L成正比，而與透過率T成反比。

2                      比爾—朗伯定律數(shù)學表達式：

A=lg(1/T)=KLc

A為吸光度，T為透過率，是出射光強度（I）比入射光強度(I0)，T=I/I0。

K為摩爾吸光系數(shù)。它與吸收物質(zhì)的性質(zhì)及入射光的波長λ有關(guān)。

C為吸光物質(zhì)的濃度，單位為mol/L，L為吸收層厚度，單位為cm。

2                      適用條件：

(1) 入射光為平行單色光且垂直照射；

(2) 吸光物質(zhì)為均勻非散射體系；

(3) 吸光質(zhì)點之間無相互作用；

(4) 輻射與物質(zhì)之間的作用僅限于光吸收，無熒光和光化學現(xiàn)象發(fā)生；

(5) 適用范圍：吸光度在0.2~0.8之間。

01UV測試中的應用

由朗伯比爾定律可知，吸光度A與樣品濃度C（同樣厚度）是成正比關(guān)系的，因此這就UV儀器分析中基本理論，利用標準曲線法進行未知樣品濃度的測定。

標準曲線的橫坐標(X)表示可以精確測量的變量(如標準溶液的濃度)，稱為普通變量，縱坐標(Y)表示儀器的響應值(這里指的是吸光度)，稱為隨機變量。當X取值為X1, X2,…… Xn時，儀器測得的Y值分別為Y1, Y2, …… Yn。將這些測量點Xi, Yi描繪在坐標系中，用直尺繪出一條表示X與Y之間的直線線性關(guān)系，這就是常用的標準曲線法。用作繪制標準曲線的標準物質(zhì)，它的含量范圍應包括試樣中被測物質(zhì)的含量，標準曲線不能任意延長。用作繪制標準曲線的繪圖紙的橫坐標和縱坐標的標度以及實驗點的大小均不能太大或太小，應能近似地反映測量的精度。

02固定波長法

標準曲線的建立（UV定量測試方法的運用，以軟件LabSolutions UV-Vis為例）。

圖示：Labsolutions UV-Vis軟件定量法測試界面

圖示：定量[參數(shù)]窗口

選擇“固定波長”，指定波長1的具體波長，右側(cè)標準曲線中“零截距”一般不需要勾選，如果勾選了，標準曲線會強制過原點（0,0），但實際測試中，標準曲線的截距多少還是會有的，這和標準樣品的空白有較大的關(guān)系。

只有當標準樣品只有一個時，這時如果還需要進行測試，可以勾選“零截距”，兩點才能形成一條直線。

03雙波長法

總氮的測定：硝酸根離子在紫外線波長220nm有特征性的量大吸收，但是也有其他溶解性有機物的干擾，而在275nm波長則基本沒有吸收值。因此，可分別于220和275nm處測出吸光度。A220及A275按下式求出校正吸光度A：

A= A220—2×A275

校正吸光度A與溶液濃度符合朗伯比爾定律，從而繪制標準曲線以測試未知樣品濃度。

圖示：[登錄波長]窗口

在“登錄波長”窗口設(shè)置所需要的波長220、275nm。

圖示：定量[參數(shù)]窗口

在定量參數(shù)窗口就要設(shè)置“雙波長差”的計算方法，并在275nm波長的因子處設(shè)置為2，從而校正吸光度A=AWL220-2×AWL275，其余部分就和單波長測試標準曲線設(shè)置類似。后續(xù)測試時，有個重要的差異，由于這是雙波長，就需要使用“基線”功能，設(shè)置波長范圍覆蓋220、275nm，例如200~280nm。否則使用“自動調(diào)零”的話，就只是當前波長調(diào)零，而不能同時使220、275nm吸光度都調(diào)零。

04K因子測試方法

圖示：定量[參數(shù)]窗口

如果已經(jīng)知道標準曲線的具體公式，可以選擇“指定標準曲線因子（K因子）”法，再指定K0、K1的值，就可以在軟件中生成標準曲線，后續(xù)直接測試未知樣品的吸光度就能計算出相應的濃度。