摘要本應用介紹了在 1290 超高性能液相色譜/6460A 串聯(lián)四極桿液質聯(lián)用儀上利用極性切換及和盒式分析技術進行代謝物穩(wěn)定性研究的方法。這種 UHPLC/MS/MS 方法具有以下優(yōu)點：• 高通量分析（在流動相流速 1.5 mL/min，泵壓為 1,100 bar 條件下，保留時間小于0.8 min）• 快速的 MS/MS 分析，周期僅為 114 ms，在極性切換(極性切換速度是 30 ms)的模式下可以采集 6 個 MRM transitions• 優(yōu)異的峰面積[%]或相對峰面積的相對標準差（RSD）精度[%]，即使對于半峰寬為0.37 秒的組分峰，也能得到足夠的數(shù)據(jù)點（至少 9 個數(shù)據(jù)點）• 使用內標或外標校準曲線得到的結果精度為 90.7%-107.1%• 極性切換模式或單極性模式得到的分析結果（殘留原藥的百分數(shù)，%）接近• 出色的色譜分離度避免了由于源內碰撞解離將代謝物轉化成母體藥物而導致的定量分析結果偏高。

前言體外藥物的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）研究，例如代謝物穩(wěn)定性研究，對于早期認識藥物體內代謝動力學特征并及時摒棄在藥物開發(fā)后期會失敗的非藥物類化合物具有重要意義。因此，需要建立快速分析方法以進行藥物發(fā)現(xiàn)早期階段涉及的大量化合物的篩查分析。通常使用盒式分析和快速 LC/MS/MS 方法進行代謝物穩(wěn)定性評估研究。在盒式分析過程中，為了減少需要分析的樣品數(shù)量，需要對孵育后的混合底物進行正相或負相的離子化。使用高流速和亞 2 微米填料色譜柱的快速液相色譜方法可以減少分析時間并提高分析通量[1, 2]。通常采用串聯(lián)四極桿液質聯(lián)用儀及多反應監(jiān)測模式（MRM）進行檢測分析。盒式分析的目的是，將能在正離子模式或負離子模式下底物組分混和在一起進行液質分析。其原因在于,對于快速液相色譜得到很窄的色譜峰，質譜分析如果無法以足夠快的速度對單個峰采集到九至十個數(shù)據(jù)點，那么就無法保證定量數(shù)據(jù)的準確度。然而，將能在正離子模式或負離子模式下底物組分混和在一起仍然顯現(xiàn)了其靈活性的優(yōu)點。本項工作介紹了幾種技術聯(lián)用的優(yōu)點，不僅使用盒式分析和快速液相色譜，而且利用快速極性切換的 MS / MS 分析以提高分析效率和在代謝物穩(wěn)定性研究中的靈活性, 同時保證良好的準確度和精度。而且，安捷倫 1290 Infinity LC的流量范圍達 2 毫升/分鐘時其泵壓力可以達到 1200 bar，這保證了臨界峰之間的良好分離度。

實驗化學試劑和備件鹽酸維拉帕米購自 SigmaAldrich (St. Louis, MO USA)。右美沙芬(Dextromethorphan), 雙氯芬酸(diclofenac)和去甲右美沙芬-d3 (內標) 購自 Cerilliant (RoundRock, TX USA)。氘代 d4-雙氯芬酸(苯基氘代d4) 購自 CDN Isotopes (Quebec, Canada)。還原型輔酶 II（NADPH）再生系統(tǒng)，溶液 A (b-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽 (NADP), 葡萄糖-6-磷酸和氯化鎂水溶液)和溶液 B (葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的 5 mM 檸檬酸鈉溶液)以及.5 M 磷酸鉀溶液, pH 7.4 購自 BD Biosciences。其它的試劑盒有機溶劑都是分析級并購自 VWR。

鼠肝的底物的孵育 S9 餾分第一階段代謝（phase I metabolism）的孵育混合物由相當于 0.3 mg 蛋白質的 S9 組分，1 µM底物（鹽酸維拉帕米，右美沙芬或雙氯芬酸，它們是用濃度為 100 µM 儲備液經70%水/ 30%乙腈制備而來），1.3 mM 的 b-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽 (NADP)，3.3 mM 葡萄糖-6-磷酸，3.3 mM 氯化鎂溶液和0.1 M 磷酸緩沖液配制的 0.4 U/mL 的葡萄糖6-磷酸脫氫酶（pH 7.4)，制備成總體積為 300 µL的溶液。在 37°C 下進行孵育。孵育后制成四種底物的混合溶液以降低分析時間。取 25 µL0, 5, 10, 15, 25 和 35 min 時的孵育液，用 300 µL含有去甲右美沙芬-d3 和氘代 d4-雙氯芬酸的乙腈溶液停止反應，然后在 14000 g 下離心 10 分鐘。取上清液，然后緩緩地用氮氣吹干。用含0.1%甲酸的水/乙腈（80/20 v/v）的溶液再溶解，用于 UHPLC/MS/MS 分析。儀器Agilent 1290 Infinity 液相色譜配置：• 1290 Infinity 集成脫氣機的高壓二元泵, 1290溫控自動進樣器和 1290 柱溫箱• Agilent 6460A 噴射流離子聚焦三重串聯(lián)四極桿液質聯(lián)用儀• Agilent MassHunter 質譜工作站用于數(shù)據(jù)的采集和處理• Agilent MassHunter Optimizer 方法優(yōu)化軟件• Agilent Zorbax SB-C18, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm色譜柱

Agilent 1290 Infinity 液相色譜分析方法流動相為:A 相: 含 0.1%甲酸的水溶液B 相: 含 0.1%甲酸的乙腈溶液進樣體積: 1 µL洗針: 在洗針座用含 0.1%甲酸的甲醇水（50/50 v/v）溶液洗針 20 秒UHPLC 方法 1:柱溫: 25°C 或 40°C流速: 1.0 mL/min梯度: 25% B 保持 0.2 min, 在 1 min 80% B, 在1.25 min 80% B, 在 1.26 min 25% B, 停止時間：1.8 minUHPLC 方法 2:柱溫: 60 °C流速: 1.5 mL/min梯度: 25% 保持 0.2 min, 在 0.73 min 80% B, 在1.00 min 80% B, 在 1.01 min 25% B, 停止時間：1.5 minAgilent 6460A 三重串聯(lián)四極桿液質條件：掃描模式: 多反應監(jiān)測模式(MassHunter 優(yōu)化軟件幫助您快速獲得最佳的碰撞電壓和碰撞解離能量，已經優(yōu)化好的質譜參數(shù)參見表 1, 2和 3)極性：正/負切換模式，正模式或負模式參 數(shù)：干 燥 氣溫度： 350°C, 干 燥 氣流速 :10 L/min, 鞘流氣溫度: 400°C 鞘流氣流速:12 L/min, 霧化器壓力: 35 psig, 錐口電壓: 0 V (+)1000 V (-), 毛細管電壓: 4,000 V (+/-)正負切換速度: 30 ms

?

結果與討論快速極性切換模式下采集速度和數(shù)據(jù)結果的質量在高流速（1.0 mL/min 或 1.5 mL/min）和高壓（至 1,100 bar）的條件下的超高性能液相色譜分離，分離時間僅需 1.5 min，但組分的半峰寬小于 1 秒（一般是 0.4 至 1.0 sec)。由于質譜分析具有很低的循環(huán)時間，所以針對每個峰能采集到足夠的數(shù)據(jù)點(> 9 數(shù)據(jù)點)，這樣就保證了定量結果的精確度(峰面積 RSD [%] 和相對峰面積 RSD [%] = 目標組分的峰面積/ 內標組分的峰面積，相對標準偏差 < 10%)。圖 1 是流速在1.5 和 1.0 mL/min 條件下，MRM 離子流圖，數(shù)據(jù)質量和分析時間的結果比較。如果要得到好的定量分析結果，則要求每個峰需要 9-10 個數(shù)據(jù)點。組分峰越窄，質譜檢測器就需要具有越高的采集速度。質譜分析的周期被縮短。在每個循環(huán)周期內，質譜需要采集在正負切換下的 6 個 MRM transitions。圖 2 是 30ms 的正負切換速度和 114 ms 的循環(huán)時間周期的條件下雙氯芬酸的分析結果。圖中顯示組分峰的半峰寬 0.37 sec，每 個峰的數(shù)據(jù)點是9 個，所以峰面積和相對峰面積的精度很好，分別是 4.8 和 7.9%。