患者樣本中存在的一些生物分子能夠為疾病診斷提供關鍵的檢測指標，例如疾病代謝物和蛋白質標記物?，F(xiàn)有的分離方法通常采用沉淀法，費時昂貴且要條件優(yōu)化。本文中，我們通過使用 NMR 和 Off-Gel 方法來進行評估，展示了如何通過超濾快速、精確、高效地分離血清中生物分子。

下載本篇《Vivaspin® Turbo 4 PES: 一種分離疾病代謝物和蛋白質的經(jīng)濟方法》應用說明，了解超濾系統(tǒng)如何在經(jīng)濟效益，具有同樣的有效性質，簡單易操作的前提下完成該過程。

目前，人們普遍采用多重親和去除系統(tǒng)(Multiple Affinity Removal System, MARS)從人血清、血漿和其他生物液體中分離高豐度蛋白質（白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、轉鐵蛋白和結合珠蛋白）。去除這些高豐度蛋白質可以有效地擴大動態(tài)范圍，從而改善血清樣本的LC/MS和電泳結果。但是，使用該系統(tǒng)會給用戶帶來高昂的成本（4×w.r.t.超濾）。

我們通過超濾的方式，以蛋白質的大小和結構為基礎，在驅動力（通常由離心或壓力條件產(chǎn)生）下將樣品通過膜分離。

具體步驟如下

1、濃縮管制備

用 0.1NHCl沖洗Vivaspin® Turbo 4，重復沖洗 3 到 4 次。

2、樣品采集、超濾和分析

• 從患者身上抽取血樣并提取血清

• 使用 Vivaspin® Turbo 4，50kda MWCO PES（4000g，7min）高豐度血清蛋白

• 使用 Vivaspin® Turbo 4，3kDa MWCO PES 濃縮濾液（4000g，7min）

• 濃縮物的Off-Gel進行區(qū)帶分離分離（蛋白質>3kDa）

• 超濾透過液的核磁共振（代謝產(chǎn)物<3kDa）

以上步驟即可實現(xiàn)蛋白質從代謝物中分離，但是需要注意的是用去離子水進行預沖洗無法有效去除干擾物，因此在核磁共振圖譜中觀察到雜質峰（圖1）。因此使用0.1NHCl溶液進行預沖洗（一個濃縮管的預沖洗量為12 ~ 14 mL，是Vivaspin® Turbo 4PES的 3 ~ 4 倍）。

結論

通過Off-Gel分離對濃縮物進行分析（圖2），含有小代謝物的濾液則通過核磁共振進行分析（圖3）。因此超濾方式是簡單高效的，對一個樣本的分析成本估計會是MARS的四分之一。