綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基(PDP)的操作步驟與應(yīng)用！

一、背景

綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基(PDP)用于綠膿桿菌的綠膿菌素測(cè)定試驗(yàn)。

1、檢驗(yàn)原理：蛋白胨和甘油提供碳氮源；氯化鎂和硫酸鉀促進(jìn)綠膿色素和熒光素的產(chǎn)生；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

2、原理：銅綠假單胞菌能產(chǎn)生的綠膿菌素能被氯仿提取，且在水中溶解度比氯仿大，并且會(huì)發(fā)生可逆的氧化還原反應(yīng)，氧化時(shí)堿性呈藍(lán)色，酸性呈紅色。所以加入鹽酸溶液并震搖后，綠膿菌素會(huì)由氯仿轉(zhuǎn)移至鹽酸溶液中，并在酸性環(huán)境中呈紅色。

3、用法：稱取本品49.4g,另稱取10g甘油,溶解于1000ml蒸餾水中,分裝,121℃高壓滅菌15分鐘,備用。

二、操作步驟

1、按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、SN標(biāo)準(zhǔn)、FDA標(biāo)準(zhǔn)或其它方法制備樣品液

2、取樣品液1ml加入冷卻至45-50℃顯色培養(yǎng)基中混勻或涂布于平板上

3、36±1℃培養(yǎng)18～24h，選用有30～200個(gè)菌落的平板，計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型大腸桿菌菌落。大腸桿菌典型菌落為藍(lán)綠色，其它細(xì)菌為無色或黃色菌落。總大腸桿菌=藍(lán)綠色菌落

4、對(duì)可疑大腸桿菌菌落可劃線接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑取單菌落做大腸桿菌全套生化試驗(yàn)

綠膿桿菌，又稱銅綠假單胞菌（學(xué)名：Pseudomonasaeruginosa），1882年首先由Gersard從傷口膿液中分離到，是一種革蘭氏陰性菌、好氧、呈長(zhǎng)棒形的細(xì)菌，只有單向的運(yùn)動(dòng)性。它是一種機(jī)會(huì)性感染細(xì)菌，且對(duì)植物亦是機(jī)會(huì)性感染的，感染后因膿汁和滲出液等病料呈綠色。綠膿桿菌，廣泛分布于自然界及正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌之一。

三、應(yīng)用

用于紅樹林土壤VBNC細(xì)菌的分離及其銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制作用研究：

紅樹林作為一個(gè)微生物資源寶庫,咸淡水規(guī)律交替的特殊環(huán)境,強(qiáng)酸性、強(qiáng)還原性、高鹽量的特性使其有可能存在許多具有特殊功能的細(xì)菌,其中不乏活的不可培養(yǎng)（viablebutnon-culturable,VBNC）狀態(tài)菌。但是目前傳統(tǒng)方法只能分離到環(huán)境中不到總量的0.01%-10%微生物,限制了人們對(duì)紅樹林微生物資源的認(rèn)識(shí)并影響了對(duì)其機(jī)能的正確把握。

利用藤黃微球菌產(chǎn)生的復(fù)蘇促進(jìn)因子（resuscitation promoting factor,Rpf）和MPN（most probable number）培養(yǎng)體系相結(jié)合,分離紅樹林土壤中可復(fù)蘇培養(yǎng)的VBNC資源菌種,并篩選出對(duì)群體感應(yīng)有抑制作用的菌株,嘗試探索微生物VBNC現(xiàn)象與群體感應(yīng)之間的相關(guān)性。

本次實(shí)驗(yàn)共分離純化菌株144株,其中VBNC狀態(tài)菌83株,分別屬于4個(gè)門Actinobacteria、Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes,6個(gè)綱,12個(gè)目,12個(gè)科和22個(gè)屬?；诶靡褕?bào)道用于檢測(cè)群體感應(yīng)（quorum sensing,QS）的菌株CV026（Chromobacterium violaceum ATCC 31532）和VIR07（Chromobacteri m violaceum ATCC 12472）,對(duì)分離獲得的51株菌株進(jìn)行比對(duì)篩選,發(fā)現(xiàn)一株群體感應(yīng)抑制效果的菌株LQC3M004（Lactobacillus brevis）。

研究發(fā)現(xiàn),該菌株經(jīng)過信號(hào)分子誘導(dǎo)后的裂解液能顯著降低銅綠假單胞菌綠膿菌素和生物膜產(chǎn)生量,當(dāng)裂解液蛋白濃度為1mg/mL,2mg/mL時(shí),對(duì)綠膿菌素產(chǎn)生的抑制率分別為25.16%,30.75%;當(dāng)裂解液蛋白濃度為1 mg/mL時(shí)對(duì)生物膜的抑制率為16.93%,而裂解液蛋白濃度在2 mg/mL時(shí)其抑制率達(dá)到33.00%。

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