谷胱甘肽還原酶（GR）活性測(cè)定試劑盒（紫外分光光度法）

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1117

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一(通常昆蟲中GR被TrxR取代)。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應(yīng)中對(duì)活性氧清除起關(guān)鍵作用，此外GR還參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)途徑。

GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時(shí)不斷消耗NADPH生成NADP⁺；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP⁺在該波長(zhǎng)無吸收峰；通過測(cè)定340nm吸光度下降速率；來測(cè)定NADPH脫氫速率，從而計(jì)算GR活性。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5.0 mL蒸餾水，混勻。

試劑三：液體×1支，4℃保存。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、 1mL石英比色皿和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（ml）1：5-10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（ml）為500-1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1ml試劑一），冰浴超聲超聲破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間3min）；然后10000rpm，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

二、GR 測(cè)定操作： 

1、分光光計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一置于25℃(普通物質(zhì))或者37℃(哺乳動(dòng)物)中預(yù)熱30min以上。

3、空白管：取1mL石英比色皿，加入850µL試劑一，100µL試劑二，50µL試劑三，充分混勻，于340nm處測(cè)定10s 和190s吸光度，記為A1和A空2，△A空白管= A空1-A空2。

4、測(cè)定管：取1mL石英比色皿，加入750µL試劑一，100µL試劑二， 100µL上清液，50µL試劑三，充分混勻，于340nm處測(cè)定10s和190s吸光度，記為A測(cè)1和A測(cè)2，△A測(cè)定管= A測(cè)1-A測(cè)2。

注意：空白管只需要測(cè)定一次。

三：GPX活性計(jì)算： 

(1) 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1µmol NADPH氧化。

GR酶活(U/mg prot)= [ (△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶] ÷(Cpr×V樣)÷T

=0.536×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr

(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中， pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1µmol NADPH氧化。

GR酶活(U/g)= [ (△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=0.536×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W

(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1µmol NADPH氧化。

GR酶活(U/10⁴ cell)= [ (△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=0.536×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量

ε：NADPH摩爾消光系數(shù) 6.22×10³L/mol/cm；V反總：反應(yīng)體系總體，1000µL=0.001 L；10⁶：1 mol=1×10⁶µmol；Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100µL =0.1mL；V樣總：加入提取液體體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，3min。

注意事項(xiàng)： 

1、樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；

2、試劑二須現(xiàn)配現(xiàn)用，配置完后，置于冰上；

3、測(cè)定前須先用1～2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保180s內(nèi)吸光值變化呈線性，哺乳動(dòng)物組織一般須用試劑一稀釋2～5倍；

4、細(xì)胞中GR活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細(xì)胞中GR的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。