人白蛋白（Alb）定量檢測試劑盒（ELISA）

定量檢測血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液中人白蛋白（Alb）的濃度。

檢測原理： 

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預(yù)包被抗人白蛋白（Alb）抗體（固相抗體）的微孔酶標板中，加入人白蛋白（Alb）校準品和待測樣本，再加入另一株HRP標記的抗人白蛋白（Alb）抗體（酶標抗體），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-酶標抗體的夾心復(fù)合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，在終止液（2M硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標儀450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中人白蛋白（Alb）的濃度正相關(guān)。擬合校準品曲線，可以計算出樣本中人白蛋白（Alb）的濃度。

試劑盒限制性：  

1. 僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2. 在試劑盒標示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。

3. 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4. 使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5. 如果樣本值高于最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。

6. 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果，檢測前，請排出該因素。

7. 通過其他方法得到的檢測結(jié)果，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。

技術(shù)提示： 

1. 混合蛋白溶液時，避免起泡。

2. 加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。

3. 合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結(jié)果準確性的必要條件。

4. 使用自動洗板機時，加入一個30秒浸泡的步驟，可以提高檢測精度。

5. 底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

6. 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色。

7. 實驗中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

8. 所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

試劑盒組成與保存：

未開封的試劑盒保存在 2-8 度，不得使用過期試劑盒。

注：校準品濃度依次為：80、 40、 20、 10、 5、 2.5mg/mL。

其他用品： 

1. 酶標儀（450nm）

2. 精密移液器及一次性吸頭

3. 蒸餾水

4. 洗瓶或者自動洗板機

5. 37℃水浴鍋或恒溫箱

6. 500mL量筒

生物安全： 

1. 檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進行處置。

2. 試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3. 底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。

4. 戴上防護手套，實驗完成后che底洗手。

樣品的采集和儲存： 

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1. 細胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。

2. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。

3. 血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。

樣本收集后，無法一次檢測完畢，請按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

4. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。

將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻漿液5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。

5. 細胞提取液：貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每1×10⁶個細胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復(fù)凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。

6. 其他生物體液：1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測。

試劑準備：

1.   使用前，所有的組分都要至少復(fù)溫60min，確保充分復(fù)溫到室溫。

2.   濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶wan全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

3.   底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內(nèi)使用。

操作程序： 

所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標準品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。

1. 按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2. 從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設(shè)置標準品孔、0值孔、空白孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，0值孔加樣本稀釋液50μL，空白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。

3. 除空白孔外，標準品孔、0值孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL。

4. 用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板。

6. 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

7. 所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

結(jié)果計算： 

1. 以標準品濃度做為縱坐標（6個標準品孔，加1個0值孔，共7個濃度點），對應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標，利用計算機軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

2. 如果樣品被稀釋，通過上述方法測的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度。

試劑盒性能指標：

1. 物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣。

2. 劑量反應(yīng)曲線線性

校準品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。

3. 精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。

批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。

批間變異系數(shù)CV%小于 15%。

4. 靈敏度

zui低檢出劑量小于0.1mg/mL。

5. 回收率

三組已知的高、中、低濃度樣品，進行五次在同一個板塊內(nèi)回收率評估，回收率在85%-115%之間。

6. 特異性

本試劑盒識別天然和重組人白蛋白（Alb），與結(jié)構(gòu)類似物無交叉。

7. 穩(wěn)定性

2-8℃保存，有效期6個月。

8. 檢測范圍

2.5mg/mL – 80mg/mL。