4-香豆酸：輔酶A連接酶（4CL）活性檢測(cè)試劑盒

（紫外分光光度法）

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1005

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入6mL蒸餾水溶解，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前用6mL蒸餾水溶解備用，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

試劑五：粉劑×1支，4℃保存；加入1mL蒸餾水溶解。臨用前用蒸餾水稀釋40倍后備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶之一，主要催化肉桂酸及其羥基或者甲氧基衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酯，這些中間產(chǎn)物隨后進(jìn)入苯丙類衍生物支路合成途徑。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

4CL催化4-香豆酸和 CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm 下測(cè)有特征吸收峰，測(cè)定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反映4CL活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟：

1、紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至333nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：按體積比將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=1:1:1:1的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3、操作表：在1.5mLEP管中進(jìn)行下列操作：

4CL 活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（U/mg prot）＝[?A×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=15.87×?A÷Cpr。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（U/g 鮮重）＝[?A×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=15.87×?A÷W。

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（U/104 cell）＝[?A×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.03174×?A。

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；ε：4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

注意事項(xiàng)：

1、若?A大于0.5，將粗酶液用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

2、建議一次測(cè)定不要測(cè)定過多樣品以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時(shí)間。

3、空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過0.01。