6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）活性檢測試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號：BA1008

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

產(chǎn)品簡介：

磷酸戊糖途徑途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）依次催化NADPH合成，與能量的平衡、生長速率和細胞活力等密切相關(guān)。此外，6PGDH逆境生理中具有重要作用。6PGDH催化6-磷酸葡萄糖酸和 NADP⁺生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP⁺沒有；通過測定340nm吸光度增加速率，計算6PGDH活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前配制，加入2.2 mL試劑一，混勻；

2. 試劑三：臨用前配制，加入2mL試劑一，混勻

需自備的儀器和用品： 

低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、蒸餾水。

操作步驟（僅供參考）：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻） 

稱約0.1g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃離心10min，取上清粗酶液，待測。 

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于37℃水浴預(yù)熱30min以上。

3. 加樣表：（在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入）

于340nm處測定3min內(nèi)吸光值變化，第0s吸光值記為A1，第180s吸光值記為A2。記ΔA測定=A2測定-A1測定，ΔA空白=A2空白-A1空白。

三、6PGDH活力單位的計算

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH的酶量為1個酶活單位。

6PGDH酶活性(U/mg prot) =[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V樣)÷T

=536×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH的酶量為1個酶活單位。

6PGDH 酶活性(U/g質(zhì)量) =[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=536×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/moL/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.0002L； Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測定；V樣：反應(yīng)體系中加入粗酶液體積，0.02mL；V樣總：提取液 體積，1mL；T：反應(yīng)時間，3min；W：樣本質(zhì)量，g。

b. 用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH的酶量為1個酶活單位。

6PGDH酶活性(U/mg prot)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V樣)÷T

 =893×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH的酶量為1個酶活單位。

6PGDH 酶活性(U/g質(zhì)量) =[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W)÷T

 =893×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/moL/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.0002L； Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測定；V樣：反應(yīng)體系中加入粗酶液體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，3min；W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項：

1. 試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，當天未用完試劑保存在4℃，可保存1周。

2. 樣本處理等過程均需要在冰上進行，且須在提取當日完成酶活性測定，粗酶液避免反復(fù)凍融；

3. 若樣本初始（0s）讀值大于0.5且ΔA測定小于0.1，可嘗試將樣本進行稀釋后測定。

4. 使用96孔板測定時，可根據(jù)樣本數(shù)量將試劑一（預(yù)熱后）、二、三預(yù)混為工作液，因是根據(jù)反應(yīng)速率計算酶活，為保證每個樣本的反應(yīng)時間盡量一致不推薦同時測過多樣本。