ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)加入顯色底物后，標(biāo)準(zhǔn)品有顏色，但結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)吸光值偏低或偏高、標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)梯度等等，總結(jié)如下原因：

一、標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)吸光值偏高，超出儀器檢測(cè)范圍

ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的吸光值一般在3.0以下，若太高超出儀器檢測(cè)范圍，顯示OVER FLOW，可能原因：

1.如OD絕對(duì)值靠譜，則顯色過度TMB顯色體系中建議根據(jù)S1，S2顏色進(jìn)行判斷， 當(dāng)S1，S2深藍(lán)色，有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色時(shí)即可終止。

2.僅作單波長(zhǎng)檢測(cè)由于參考波長(zhǎng)讀取非特異性檢測(cè)，如指紋、劃痕、水漬等， 對(duì)結(jié)果也有影響。建議終結(jié)果以雙波長(zhǎng)為準(zhǔn)確。

二、標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)吸光值偏低

ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的吸光值一般要在0.8以上，若小于0.8，可能的原因：

1.粉末標(biāo)準(zhǔn)品未充分溶解粉末標(biāo)準(zhǔn)品按說明書加一定體積的液體后，輕柔混勻， 室溫靜置30分鐘，充分溶解。

3.標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融后活性降低。

4.孵育溫度、時(shí)間按說明書要求孵育條件進(jìn)行孵育。

4.顯色時(shí)間控制TMB顯色體系中建議根據(jù)S1，S2顏色進(jìn)行判斷，當(dāng)S1，S2深藍(lán)色，有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色時(shí)即可終止。

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)梯度

ELISA 實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品2倍倍比稀釋，但結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)曲線沒有梯度，可能的原因：

1.樣品或標(biāo)準(zhǔn)品污染避免污染

5.錯(cuò)誤的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋按照說明書稀釋

6.偶聯(lián)抗體濃度過高按照說明書調(diào)整到佳的濃度

4.TMB底物孵育時(shí)間過長(zhǎng)調(diào)整到合適的孵育時(shí)間

5.錯(cuò)誤的孵育時(shí)間或溫度按照說明書

6.孵育時(shí)未加蓋導(dǎo)致溶液揮發(fā)和污染貼封片或加蓋

總結(jié)

得到ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要注意幾點(diǎn)：

1、 充分溶解標(biāo)準(zhǔn)品；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品避免反復(fù)凍融；

3、 梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品注意混勻。