競(jìng)爭(zhēng)法ELISA(也稱(chēng)抑制或封閉法ELISA)通過(guò)定量某種樣品分析物對(duì)預(yù)計(jì)信號(hào)的干擾，來(lái)測(cè)定該分析物在樣品中的含量，可通過(guò)以下方式進(jìn)行：微孔板用一種分析物或一種對(duì)靶標(biāo)分析物具有特異性的抗體包被(即直接法和間接法)，再添加一種有部分某種檢測(cè)的靶標(biāo)分析物，以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體上的位點(diǎn)。信號(hào)與分析物含量呈負(fù)相關(guān)，因此，如果靶標(biāo)分析物的濃度較分析物高，靶標(biāo)分析物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有標(biāo)記抗體，參考信號(hào)將會(huì)較靶標(biāo)分析物的濃度較低的情況增強(qiáng)。

競(jìng)爭(zhēng)法的理論基礎(chǔ)是抗體，只有在抗體基礎(chǔ)上，兩種抗原才會(huì)形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。該方法一般用來(lái)檢測(cè)具有較少表位的小分子物質(zhì)

實(shí)驗(yàn)概要

以直接競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒為例，將特異性抗體吸附于固相載體，加入待測(cè)抗原(標(biāo)準(zhǔn)品或樣本)和生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗原，二者競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)溫育和洗滌后加入顯色底物。顯色的深淺與樣品中待測(cè)物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。準(zhǔn)備所有的試劑和梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。板條加入洗液靜置浸泡30 秒。標(biāo)準(zhǔn)品孔加入2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品；非特異性結(jié)合(NSB)和大結(jié)合(B0)孔加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或培養(yǎng)基。血清/血漿：樣本孔加入樣本；細(xì)胞培養(yǎng)上清：樣本孔加入細(xì)胞培養(yǎng)上清。除了Blank和非特異性結(jié)合(TA)孔空白，NSB孔加入1×檢測(cè)緩沖液，其余每孔加入稀釋的偶聯(lián)物。封膜，室溫孵育1小時(shí)，洗滌6次。除了TA和Blank孔，其余每孔加入稀釋的HRP標(biāo)記的鏈霉親和素,封膜，室溫孵育30分鐘，洗滌6次。TA孔加入稀釋的HRP標(biāo)記的鏈霉親和素。每孔加入顯色底物，避光，室溫孵育5 - 30分鐘每孔加入終止液,30分鐘內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，參考波長(zhǎng)570nm或630nm。

注：以上步驟是以研域生物ELISA試劑盒為參考，不同廠(chǎng)家的試劑盒操作步驟可能不一樣，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前一定要仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)哦~直接競(jìng)爭(zhēng)法和間接競(jìng)爭(zhēng)法的區(qū)別直接競(jìng)爭(zhēng)法：標(biāo)記抗原，與檢測(cè)樣品中的抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)法：標(biāo)記抗體，固相抗原與檢測(cè)樣品中的抗原競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記抗體。

模型

直接競(jìng)爭(zhēng)法：包被抗體，用HRP-抗原與樣本一起加入。樣本中的Ag與HRP-Ag競(jìng)爭(zhēng)Solid-Ab，固相吸附的HRP-Ag與樣本中的Ag濃度成反比；間接競(jìng)爭(zhēng)法的模型：包被抗原，用HRP-抗體與樣本一起加入。樣本中的Ag與Solid-Ag競(jìng)爭(zhēng)HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab與樣本中的Ag濃度成反比。

結(jié)合機(jī)會(huì)

直接競(jìng)爭(zhēng)法：標(biāo)記抗原與待測(cè)抗原均是液相，與抗體的結(jié)合機(jī)會(huì)是一樣的；間接競(jìng)爭(zhēng)法：固相抗原與抗體的接觸面積較小，固相抗原與待測(cè)抗原的結(jié)合抗體機(jī)會(huì)是不平等的，接近順序飽和法，即只有與待測(cè)抗原結(jié)合剩余的抗體才會(huì)與固相抗原結(jié)合。直接競(jìng)爭(zhēng)法：一般難以進(jìn)行放大，常用的有生物素化抗原與酶標(biāo)親和素；間接競(jìng)爭(zhēng)法：一般可以使用酶標(biāo)二抗。

間接競(jìng)爭(zhēng)法靈敏度大于直接競(jìng)爭(zhēng)法。

由于結(jié)合機(jī)會(huì)的差異，間接法的抑制率大于直接法，從而抑制曲線(xiàn)斜率會(huì)大于競(jìng)爭(zhēng)法，故靈敏度越大。在進(jìn)行系統(tǒng)放大時(shí)，間接法一般可以使用酶標(biāo)二抗，進(jìn)一步提高靈敏度。競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒也可以用來(lái)檢測(cè)大分子抗原甚至是抗體。檢測(cè)大分子抗原時(shí)，由于空間位阻的影響，使得該檢測(cè)方法沒(méi)有雙抗體夾心法靈敏度高。檢測(cè)抗體時(shí)，由于兩種競(jìng)爭(zhēng)的抗體來(lái)源不一，兩種抗體趨同性不高，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的可信性不高。