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            N-乙?;?β-葡萄糖苷酶(NAG)活性檢測(cè)試劑盒(微量法)

            來(lái)源:上海尚寶生物科技有限公司   2023年07月14日 15:20  

            N-乙?;?/span>-β-葡萄糖苷酶(NAG)活性檢測(cè)試劑盒(微量法)

            產(chǎn)品貨號(hào):BA1935

             

            產(chǎn)品規(guī)格:100T/48S

             

            產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

            N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.52,N-acetyl-β-D-glucosidase,NAG)廣泛分布于各種組織中,是一種細(xì)胞內(nèi)溶體酶,測(cè)定NAG活性可用于腎小管間質(zhì)性腎炎、尿路感染、糖尿病腎病綜合癥、高血壓腎病、腎移植后的排異反應(yīng)和腎病綜合癥的早期診斷。

            NAG分解N-β-乙酰氨基葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通過(guò)測(cè)定400nm下吸光度的 變化來(lái)計(jì)算NAG活性。

             

            注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

             

            產(chǎn)品組成:

            試劑名稱(chēng)

            規(guī)格

            保存條件

            提取液

            液體60mL×1

            2-8

            試劑一

            液體10mL×1

            2-8

            試劑二

            粉劑×1

            -20

            試劑三

            液體20mL×1

            2-8

            標(biāo)準(zhǔn)品

            液體1mL×1

            2-8

            溶液的配制:

            1. 試劑二:臨用前取一瓶加入2mL蒸餾水溶解備用;可-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融;

            2. 標(biāo)準(zhǔn)品:5μmol/mL的對(duì)硝基苯酚溶液。臨用前用蒸餾水將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋8倍得0.625μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

             

            需自備的儀器和用品:

            可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、臺(tái)式離心機(jī)、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管。

             

            操作步驟:

            一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

            1. 組織:按照組織質(zhì)量(g:提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取0.1g組織,加入1mL提取液),冰浴勻漿。15000g4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

            2. 細(xì)菌、細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量104個(gè):提取液體積(mL500~1000:1的比例,建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)胞(冰浴,功率200w,超聲3s,間隔7s,總時(shí)間3min),然后15000g,4℃,離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

            3. 血清(漿)等液體:直接測(cè)定。

            二、測(cè)定步驟

            1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm,蒸餾水調(diào)零。

            2. 操作表 (1.5mL離心管中依次加入下列試劑)

            試劑名稱(chēng)μL

            測(cè)定管

            對(duì)照管

            標(biāo)準(zhǔn)管

            空白管

            試劑一

            60

            60

            60

            60

            試劑二

            30

            -

            -

            -

            37℃下預(yù)熱5min

            -

            -

            蒸餾水

            -

            30

            30

            40

            標(biāo)準(zhǔn)液

            -

            -

            10

            -

            樣本

            10

            10

            -

            -

            37℃反應(yīng)30min

            -

            -

            試劑三

            200

            200

            200

            200

            混勻后室溫放置2min,吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中測(cè)定400nm的吸光度,分別記為A測(cè)定管、A對(duì)照管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管。計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。

            三、NAG活性計(jì)算

            1. 按蛋白濃度計(jì)算

            活力單位定義:每mg蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol對(duì)硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

            NAG (U/mg prot) =ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo))×1000×V÷Cpr×V樣)÷T=20.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

            2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

            活力單位定義:每g樣本在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol對(duì)硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

            NAG (U/g 質(zhì)量)=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo))×1000×V÷(V÷V樣總×W)÷T=20.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

            3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

            活力單位定義:每104個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol對(duì)硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

            NAG (U/104cell)= ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo))×1000×V÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

            =20.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量

            4. 按液體體積計(jì)算

            活力單位定義:每毫升液體在反應(yīng)體系中每分鐘催化生成1nmol對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

            NAG (U/mL)= ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo))×1000×V÷V÷T=20.83×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

            C標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度:0.625μmol/mL;V樣:加入的樣本體積,1mL;V樣總:提取液體積,0.01mL;Cpr上清液蛋白濃度,mg/mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min;細(xì)胞數(shù)量:以萬(wàn)計(jì);W:樣本質(zhì)量,g1000:換算系數(shù), 1μmol=1000nmol

             

            注意事項(xiàng):

            吸光度若大于2時(shí),建議將樣本用提取液稀釋后進(jìn)行測(cè)定。

             

             

             

             


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